[发明专利]一种提高铜绿假单胞菌检测准确性方法在审
申请号: | 201910355893.4 | 申请日: | 2019-04-29 |
公开(公告)号: | CN110106265A | 公开(公告)日: | 2019-08-09 |
发明(设计)人: | 谢小保;文霞;张淑瑶;张志聪 | 申请(专利权)人: | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) |
主分类号: | C12Q1/689 | 分类号: | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/385 |
代理公司: | 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 | 代理人: | 刘明星;朱聪聪 |
地址: | 510070 广东省广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 铜绿假单胞菌 细菌 检测 检出 繁殖能力 实时荧光定量PCR 平板培养基 传统平板 细菌DNA 后提取 总DNA 叠氮 扩增 溴化 配制 受损 | ||
本发明公开了一种提高铜绿假单胞菌检测准确性方法。它是配制样品备检溶液、向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应,反应完毕后提取细菌总DNA,再用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌。本发明采用铜绿假单胞菌PCR技术+PMA可检出传统方法无法检出的VBNC细菌,同时加入PMA可有效避免死菌和受损菌DNA扩增,由于VBNC细菌丧失了在平板培养基上的繁殖能力,传统平板培养法无法检出,而本发明是通过扩增细菌DNA的方法检测细菌数量,无需细菌具有繁殖能力,因此,本发明比传统方法检测准确性高。
技术领域
本发明属于化妆品微生物检测领域,具体涉及一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的PMA-qPCR检测方法及试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰阴性的条件致病菌,广泛分布于自然界的空气、水和土壤中,化妆品营养丰富,在生产和使用过程中很容易受到污染,不仅使产品质量下降,更严重的是损害消费者的健康,因此,对化妆品中铜绿假单胞菌的检测至关重要。但是,该菌与大多数非芽孢细菌一样,在外界不良环境的刺激下(如低温、消毒剂或防腐剂),可进入一种活的非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC),该种状态的细菌在传统培养基上丧失繁殖能力,常规平板培养法无法检出,但其致病力和毒力仍然存在,同时,VBNC细菌仍有呼吸、转录和蛋白合成等代谢活性,一旦条件允许,其可重新繁殖生长,从而引起不可预测的微生物安全风险,威胁消费者的健康。因此,建立铜绿假单胞菌VBNC状态菌的有效监测方法,对化妆品微生物安全具有重要的意义。
目前,随着分子生物学的快速发展,PCR技术已广泛应用于各行业的微生物安全监测中,其具有耗时短、特异性强、灵敏度高的优点,但是常规PCR技术是检测样品中所有的细菌数,包括活细菌、死菌或受损菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够检测铜绿假单胞菌VBNC状态细菌的提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法。
本发明采用低温使铜绿假单胞菌进入VBNC状态,采用热处死的方法使铜绿假单胞菌活死菌同时存在的状态,采用PMA-qPCR技术来选择性检测铜绿假单胞菌的数量,并与传统方法比较,建立一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的PMA-qPCR检测方法,从而实现了本发明的目的。
本发明的提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
配制样品备检溶液、向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应,反应完毕后提取细菌总DNA,再用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌。
所述的用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌是针对铜绿假单胞菌oprL基因进行实时荧光PCR检测。
所述的向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应优选为加入叠氮溴化丙锭的终浓度为5.0~15.0mg/L,混匀后25℃避光反应15min,取出置于冰上,500~750W的卤素灯照射15min,光照距离为20~30cm;光照反应结束后,收集菌体。
所述的样品备检溶液是按每取10g化妆品样品加入10g灭菌吐温-80和80mL灭菌生理盐水,震荡混匀,制成1:10的样品备检溶液。
所述的针对铜绿假单胞菌oprL基因进行实时荧光PCR检测,其在实时荧光PCR检测中的引物对为:
oprL-F:5’-AGCAGCCACTCCAAAGAAACC-3’,具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
oprL-R:5’-CCAGAGCTTCGTCAGCCTTG-3’,具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
优选,所述的实时荧光PCR检测的反应体系包括:premix Ex Taq 10μL,10μmol/L的上、下游引物各0.3μL,50×Dye0.4μL,DNA模板1μL,ddH2O 8μL。
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