[发明专利]一种丛生福禄考ISSR-PCR分子标记辅助育种方法

说明书

本发明涉及一种丛生福禄考ISSR‑PCR分子标记辅助育种的方法。包括以下步骤1)提取丛生福禄考基因组DNA；2)ISSR‑PCR扩增。本发明建立的丛生福禄考ISSR‑PCR反应体系，条带稳定性高，清晰度高，弥补了国内外对丛生福禄考遗传多样性研究的不足，发明的成果可用于丛生福禄考遗传关系、分子标记辅助育种、新品种选育等方面，具有很大的科学价值与应用价值。

技术领域

本发明涉及一种丛生福禄考ISSR-PCR分子标记辅助育种的方法。

技术背景

丛生福禄考(Phlox subulata L.)为花荵科福禄考属宿根花卉，匍匐性草甸状，茎丛生密集成垫状并沿地面生长，在我国东北地区可正常越冬。作为一种应用前景广阔的地被植物，花色丰富艳丽，每当开花季节，繁盛的花朵将茎叶全部遮住，形成花海、繁花似锦，不但可以栽植于平坦地面，还可以在普通草坪、花卉不易生长养护的零散隙地、陡峭山坡等地种植。丛生福禄考，具有观赏价值高、适应性强、耐粗放管理等优良特性，是一种不可多得的园林应用材料。然而，丛生福禄考品种多样，亲缘关系复杂，给育种带来了很大的困难。

分子标记辅助育种作为一种现代育种手段，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。简单重复序列多态性(ISSR)可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行遗传多样性分析，为物种演化和分类研究提供DNA水平上的证据；可以同时检测基因组多个SSR位点；可以采取类似RAPD的方法寻找与所定位基因组相连锁的DNA标记，快速完成基因定位；可以在生长周期的任何阶段进行检测，且DNA用量少；通常为显性标记。ISSR分子标记技术已被广泛应用于许多植物的遗传多样性分析中,但对于丛生福禄考分子标记的研究现仍处于起步阶段。

发明内容

一种丛生福禄考ISSR-PCR分子标记辅助育种的方法，包括以下步骤：

1)提取丛生福禄考基因组DNA；

2)ISSR-PCR扩增。

步骤2)ISSR-PCR扩增反应体系：在25μL反应体系中，包括10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，dNTPs 0.15mmol/L，引物800pmol/L，DNA模板40ng，Taq酶1.5U，Mgcl₂为3mmol/L。

所述的引物选自SEQ ID NO.1-11中的任一条，如下表1所示：

表1引物信息表

步骤2)ISSR-PCR扩增的条件为：95℃预变性8min，30个循环，每个循环包括，94℃变性30s，48-55℃退火1min，72℃延伸2min，结束循环后72℃延伸10min。

本发明建立的丛生福禄考ISSR-PCR反应体系，条带稳定性高，清晰度高，弥补了国内外对丛生福禄考遗传多样性研究的不足，发明的成果可用于丛生福禄考遗传关系、分子标记辅助育种、新品种选育等方面，具有很大的科学价值与应用价值。

附图说明

图1是ISSR-PCR正交试验设计反应体系的扩增结果：

M表示：DL2000Marker；引物为FI-48；1-16为表2的处理组合1-16。

图2是筛选出的适合丛生福禄考ISSR扩增的引物扩增结果：

M表示：DL2000Marker；1.FI-8；2.FI-18；3.FI-20；4.FI-35；5.FI-40；6.FI-43；7.FI-48；8.FI-49；9.FI-50；10.FI-55；11.FI-59。

图3是引物FI-48最佳退火温度的确定：