[发明专利]一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的重组载体和表达方法

说明书

本发明公开了一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的重组载体，本发明还公开一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的表达方法。本发明构建了大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的原核表达载体，并且针对蛋白表达条件进行一系列的优化，最终得到HgGLAND59可溶性蛋白，其结果为进一步研究蛋白晶体结构和生物学特性奠定基础，为设计针对HgGLAND59为靶标的农药研制提供思路，进而为防治大豆根结线虫提供依据。

技术领域

本发明涉及一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的重组载体和表达方法，属于生物技术领域。

背景技术

根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。根结线虫病主要为害大豆根尖，豆根受线虫刺激，病株矮小，叶片黄化，严重时植株萎蔫枯死，田间成片黄黄绿绿，参差不齐。拔起病株可看到根系不发达，根瘤疏落。根部可见到白色或黄白色的小颗粒，即线虫的胞囊，后期胞囊色彩变深，为褐色。根上的胞囊为此病诊断的主要依据。

虫媒病害的发生与否和流行的严重程度，依赖于病毒-昆虫-植物三者互作关系。在植物与植食性昆虫防御与反防御的博弈中，当植物感受到植食性昆虫的信号时，能迅速激活植食性昆虫分子模式相关的免疫信号转导，继而调控众多抗性相关基因的转录表达，介导防御物质的合成，从而提高植物对昆虫侵害的抵御能力。为了应对植物的抗性免疫，植食性昆虫在取食过程中可以分泌特异性的唾液效应子来抑制植物的免疫激活，从而抑制植物防御基因的表达和抗性物质的合成，进而保证昆虫在寄主植物上正常的取食、生长与繁衍。近年来，不断的有昆虫效应蛋白基因被克隆的报道，如烟粉虱、根结线虫、禾谷类作物孢囊线虫等中的效应蛋白基因也已先后被分离克隆。

基因的原核表达是研究基因功能的常用技术之一。蛋白原核表达时常常存在大肠杆菌中由于稀有密码子造成表达限制，形成包涵体；毒性较强的蛋白表达时会抑制蛋白的表达，造成表达产量过低；另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，导致表达产物不溶。针对上述难题，通常的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。但此方法步骤繁琐，成功率低。目前大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因已被发现，但如何将其以可溶性形式表达出来尚是本领域的难题。本发明通过选用不同的细菌菌株、采用不同的诱导温度以及诱导剂IPTG的浓度来筛选HgGLAND59 蛋白可溶性表达的条件，为基因功能学、蛋白质晶体等研究打下基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的重组载体和表达方法。

本发明的技术方案是：一种大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的重组载体，所述重组载体的制备方法如下：提取大豆根结线虫的RNA，并反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增HgGLAND59基因；将HgGLAND59扩增产物经 BamHI和XhoI双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pET-28a-HgGLAND59。

优选地，以cDNA为模板，利用以下引物扩增HgGLAND59基因，引物序列如下：

上游引物：HgGLAND59-F：GCGAATTCATGGCGATTTTCTGCGACTGT下划线为BamHI酶切位点；

下游引物：HgGLAND59-R：CGCTCGAGTCATTTCCGTCCAAGGTCAGT 下划线为XhoI酶切位点；

上下游引物分别如SEQ ID NO.3、4所示。

本发明还提供一种表达大豆根结线虫效应蛋白HgGLAND59基因的方法，包括以下步骤：

(1)用权利要求1或2所述的重组载体转化大肠杆菌细胞，得到表达 HgGLAND59的重组原核表达菌株；