[发明专利]基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法

说明书

基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法，包括以下步骤：（1）在须糖多孢菌基因组中找到ura4作为负筛选标记基因；（2）在ura4基因的两端设计分别设计一段大小为1 kb的序列用于进行ura4基因替换的同源臂；（3）采用融合PCR将ura4基因上、下游同源臂与阿泊拉抗性基因进行融合，并与质粒pOJ260进行连接，获得重组质粒pOJ260‑ura4；（4）将含有重组质粒pOJ260‑ura4的原生质体转入须糖多孢菌中，进行ura4基因的敲除，获得ura4缺失菌株S.pogona‑Δura4，通过线性片段同源重组技术对所述ura4缺失菌株S.pogona‑Δura4进行须糖多孢菌基因簇的阻断。本发明无需构建载体、引入外源重组酶，可在短时间内获得具有靶标基因簇阻断的阳性单克隆，提高须糖多孢菌非靶标基因簇阻断的效率。

技术领域

本发明涉及一种须糖多孢菌进行基因簇阻断的方法，具体涉及一种基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法。

背景技术

丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌产生的一类具有杀虫活性的大环内酯类化合物，且具有比多杀菌素更强的杀虫活性和杀虫谱，如对多杀菌素难以控制的世界性检疫性害虫和重要农业害虫烟青虫具有很好的生物防治作用，已成为当前最具发展前景的新型生物农药之一。但是，野生型须糖多孢菌合成丁烯基多杀菌素的能力较弱且发酵周期长，制约着丁烯基多杀菌素的大规模工业化生产和应用。因此，如何缩短发酵周期以及提高丁烯基多杀菌素的产量成为当前急需解决的热点问题。

丁烯基多杀菌素的生物合成是采用典型的I型PKS(Polyketide synthase，聚酮合酶)途径来完成，通过催化前体物质进行反复的缩合反应，形成聚酮体，随后进行糖基化和甲基化修饰形成最终产物。然而，该过程的进行可能受到其它次生代谢产物基因簇的竞争性抑制，如竞争性利用前体物质。须糖多孢菌全基因组测序结果显示，该菌株基因组存在除丁烯基多杀菌素基因簇外的其它27个次生代谢产物基因簇。这些基因簇的表达很可能使得丁烯基多杀菌素生物合成前体供应减少，最终影响丁烯基多杀菌素生物合成。因此，通过阻断非靶标基因簇来减少对合成前体的利用，有望成为提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法。如Meng等人在阿维链霉菌中通过对Ⅲ型基因簇rpp进行阻断，促使阿维菌素产量由1,024 mg/L提高到1,262 mg/L（Meng L, Xiong Z, Chu J, Wang Y. Enhanced productionof avermectin by deletion of type III PKSs biosynthetic cluster rpp inStreptomyces avermitilis. Lett Appl Microbiol. 2016 Nov;63(5):384-390. doi:10.1111/lam.12635.）。