[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用，属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。此系统可达到对新金色分枝杆菌进行基因编辑的目的；此系统使用的pML‑Cas9质粒和pJM‑sgRNA质粒就能够在新金色分枝杆菌中稳定存在、表达，不会随着新金色分枝杆菌的传代丢失，也不会被新金色分枝杆菌自身所存在的保护机制排斥；利用此系统的CRISPR/Cas9基因编辑系统系统对新金色分枝杆菌进行基因编辑，敲除效率较高，可达50％。

技术领域

本发明涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用，属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。

背景技术

甾体药物属于激素类药物，是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，具有极重要的医药价值，在维持生命、调节性功能、机体发育、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面均有重要的作用。这些作用使得甾体药物成为了化药工业中仅次于抗生素的第二大类药物，也使得甾体药物成为了我国药物新资源开发的重点之一，更使得甾体药物及甾体药物中间体成为了我国药物出口的重要品种。

但是，由于我国在甾体药物的生产水平上和世界先进国家相比还有一定的差距，我国现有的甾体药物品种仅为国外已经上市的甾体药物的三分之一，且大多为中低档产品，利润较低。因此，急需提升我国甾体药物的生产水平。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要的甾体药物中间体，可通过结构上的化学修饰合成几乎所有的甾体类药物，在甾体药物的生产中占据重要地位，然而，由于底物投料浓度低、发酵转化周期长以及对甾体微生物代谢机理认知的不足等问题，我国在甾体微生物转化生产上也明显落后于世界先进国家。因此，急需提升我国甾体药物中间体ADD的生产水平，进而提升我国甾体药物的生产水平。

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)可转化植物甾醇合成雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，且具有生长快的优势，是一种极具潜力的ADD生产菌，若能对新金色分枝杆菌转化植物甾醇合成ADD过程中的3-甾酮-Δ1-脱氢酶、胆固醇氧化酶、甾酮C27单加氧酶以及3-甾酮-9α-羟化酶等关键酶进行研究，并结合代谢工程策略对新金色分枝杆菌的ADD合成相关途径进行改造，极有可能获得能够高效积累ADD的新金色分枝杆菌，此经改造的新金色分枝杆菌无疑是提升我国甾体药物中间体ADD生产水平的一个重要突破，也为提升我国甾体药物的生产水平提供了更多可能。

然而，由于新金色分枝杆菌自身所存在的保护机制排他性较强，外源基因很难在新金色分枝杆菌中稳定存在并表达，这就使得可适用于新金色分枝杆菌的基因编辑方法较少，例如，由于分枝杆菌同源重组的发生率比其他细菌明显低很多，仅为10^-6～10^-5，并且，利用同源重组对新金色分枝杆菌进行基因编辑还需在基因组上带入抗性标签，因此，利用同源重组对新金色分枝杆菌进行基因编辑具有效率低、周期长、筛选量大、操作复杂等劣势；自杀载体系统(pNIL/pGOAL系列质粒)等其他基因编辑方法虽然可以对新金色分枝杆菌进行基因编辑，但效率也不高，与同源重组相比不具备任何优势。

因此，基因编辑无疑是对新金色分枝杆菌进行代谢工程改造的一个难点，急需完善针对新金色分枝杆菌的基因编辑系统，以便更有效率地对新金色分枝杆菌进行改造。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种对新金色分枝杆菌针对性强且效率高的基因编辑系统。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包含pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒；