[发明专利]源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说，涉及L‑泛解酸内酯脱氢酶及其应用。本发明首次揭示了来源于Cnuibacter physcomitrellae的L‑泛解酸内酯脱氢酶，其对L‑泛解酸内酯具有良好的酶活性，可以应用于D‑泛解酸内酯的催化合成中。本发明构建了多酶级联催化L‑泛解酸内酯手性翻转合成D‑泛解酸内酯的体系，以共表达L‑泛解酸内酯脱氢酶、D‑酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌细胞为催化剂，避免了中间产物酮基泛解酸内酯的积累与自发水解，省去了中间产物的分离、L‑泛解酸内酯的消旋以及D‑泛解酸在酸性条件下内酯化等步骤，简化了反应过程，减少了酸碱的使用，提高了反应效率。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及源自Cnuibacterphyscomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶、其编码基因、载体、重组细胞及其应用。

背景技术

D-泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙的重要原料，在工业化生产上先通过化学法合成DL-泛解酸内酯，再利用内酯水解酶选择性水解混旋泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，接着分离D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯经消旋化后回用。因此，水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，但仍然存在步骤较长、酸碱耗用高等问题。鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D-泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法包括两种途径，第一种是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯；第二种途径也是先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯。该过程以第一条通路更为简捷，与现有的水解酶催化通路相比，工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；在基因工程菌内构建辅酶循环系统，可不需要外加辅酶；以基因工程菌作为整细胞催化剂不需要酶的分离纯化步骤。因此，氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。