[发明专利]一种葡萄糖酸盐响应元件及其应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖酸盐响应元件及其应用，属于遗传工程领域。本发明以pHT质粒为载体，在枯草芽孢杆菌中，通过优化GntR诱导调控蛋白碱基序列，解除葡萄糖分解代谢阻遏效应，通过在启动子P_srfAA、P_hbs、P_veg、P_ytxG、P_phrK、P_minC，中整合GntR转录调控蛋白结合序列，并关联绿色荧光蛋白GFP，构建优化葡萄糖酸盐响应元件文库，在发酵培养基中添加葡萄糖酸钠进行发酵验证，获得葡萄糖酸盐响应强度范围为2000～32000a.u.的诱导启动子文库，适用于不同表达强度的应用场景，具有很好的代谢工程应用前景。

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖酸盐响应元件及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

在枯草芽孢杆菌代谢工程领域，响应某种外源添加物质的诱导表达元件，广泛应用于代谢调控等方向。目前，常用于枯草芽孢杆菌中的诱导启动子，有木糖诱导启动子P_xyl和IPTG诱导启动子P_grac。但是，木糖诱导启动子P_xyl存在木糖价格昂贵的问题，IPTG诱导启动子P_grac，存在IPTG价格昂贵，以及对细胞存在一定毒性的问题。葡萄糖酸盐作为一种简单碳源，价格低廉，且对细胞无毒，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得枯草芽孢杆菌的诱导响应元件。然而，天然葡萄糖酸盐诱导启动子表达水平较低，远低于木糖和IPTG诱导启动子。同时，不同表达强度的诱导启动子文库在代谢工程领域有重要应用，可满足不同的代谢调控需求，而目前缺少不同表达强度的葡萄糖酸盐诱导启动子文库。以上因素，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，实现优化葡萄酸盐响应元件表达强度，本发明以组成型启动子P_srfAA、P_hbs、P_veg、P_ytxG、P_phrK、P_minC，分别整合转录调控蛋白GntR结合序列ATACTTGTATACAAGTATACT，构建启动子文库，实现以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为宿主时，添加葡萄糖酸盐后，达到不同诱导表达强度。

本发明的第一个目的是提供一种响应葡萄糖酸盐的诱导表达元件文库；所述元件含有第一启动子、转录调控蛋白GntR、第二启动子、转录调控蛋白GntR结合序列；所述第一启动子表达转录调控蛋白GntR，所述第二启动子整合转录调控蛋白GntR结合序列；所述第一启动子和第二启动子的转录方向相反；所述转录调控蛋白GntR结合序列为ATACTTGTATACAAGTATACT(如SEQ ID NO.3所示)。

在本发明的一种实施方式中，所述第一启动子为P_yvyD启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述第二启动子包括P_srfAA、P_hbs、P_veg、P_ytxG、P_phrK、或P_minC。

在本发明的一种实施方式中，所述元件还包括标记物。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物包括但不限于绿色荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述组成型P_yvyD启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白GntR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以质粒pHT为骨架，将所述第一启动子、转录调控蛋白GntR、整合转录调控蛋白GntR结合序列的第二启动子连接在质粒上。