[发明专利]虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及虾偷死野田村病毒、虾血细胞虹彩病毒、虾诺达病毒的三重荧光PCR检测试剂盒及其应用，试剂盒中涉及到针对三种病毒的引物、探针。利用本发明的试剂盒能快速检虾偷死野田村病毒、虾血细胞虹彩病毒、虾诺达病毒。在一个反应中采用三重荧光PCR方法可对三种病毒中的至少一种病毒进行检测。本发明具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；及时发现和确诊可疑样本，提高对病毒的监测水平。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

对虾偷死病(CMD)是由“偷死野田村病毒(CMNV)”引起的一种病毒性疾病。偷死野田村病毒属于野田村病毒科α野田村病毒属，是一种单链RNA病毒，病毒粒子为球形(二十面体)，无囊膜，直径32纳米。对虾偷死病是近年来我国养殖对虾中出险的一种新发病害。2003年或更早的时候，该病在海南、广西等地高密度养殖的凡纳滨对虾中出现，2008-2009年我国南方各省市的养殖对虾中大规模爆发，2010年后开始传播到我国山东、河北和天津等地。分子流行病学调查显示，凡纳滨对虾、中国对虾、日本对虾、斑节对虾、脊尾白虾、罗氏沼虾和梭子蟹中均能检出CMNV阳性，这说明CMNV不仅能够感染目前我国养殖对虾的主要经济种类，还能感染其他甲壳类动物，由此可见CMNV宿主范围可能非常广泛。

目前对CMNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；而这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于CMNV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。

虹彩病毒病是一种广泛存在于水生动物且危害较大的病毒性疾病。目前，虹彩病毒成为一些鱼类、两栖类动物的新型病原体，特别是水产养殖业中的经济类品种再加上其特殊的生物学特性，因此越发引起人们的关注和重视。

对虾感染虹彩病毒，最早于1993年Lightner和Redman在靠近厄瓜多尔对虾养殖场发现了被虹彩病毒感染的原糙对虾(ProtrachypeneprecipuaBurkenroad)。这是首次报道十足目动物能够感染虹彩病毒。对感染虹彩病毒的原糙对虾组织病理学观察发现，表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒的感染；造血组织，触角腺上皮组织，以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。

2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，相关研究报道称新分离的病毒属于虹彩病毒科，但不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，感染该病毒的虾造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，因此命名为虾血细胞虹彩病毒(SHIV)。该病毒与2014年国家海洋局第三海洋研究所的科研人员从红螯螯虾中分离的红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)的基因序列一致，属于同一种病毒的不同分离株。