[发明专利]一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用

权利要求书

1.一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.表达权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的载体或宿主菌。

4.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达方法，其特征在于：采用Trichoderma reesei TrCel61A的信号肽来实现EpLPMOa在酵母的高效分泌。

5.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

S1：采用Trichoderma reesei TrCel61A 的信号肽序列取代pPICZαA 中alpha 信号肽序列；

S2：以PMOa_f1/ PMOa_r1为引物，以微细正青霉4-14菌株的cDNA为模板通过PCR扩增得到目的基因片段，并将该基因克隆到载体pEASY-Blunt中得到pEASY-EpLPMOa；再以pEASY-EpLPMOa为模板和引物PMOa_f2和PMOa_r2，通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和6xHis 标签的EpPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒Hieff CloneTMOne Step Cloning Kit，同源重组到pPICZ-TrS载体中获得表达载体 pPICZ-EpLPMOa；

引物PMOa_f1 和 PMOa_r1序列分别为：

5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’

5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT-3’

引物PMOa_f2 和 PMOa_r2序列分别为：

5’-TTGCTACTGGTGTTGTGGGACATGGCTACGTCTCCAGCAT-3’，

5’-AGATGAGTTTTTGTtctagaTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGACCGCTATACAGCGC-3’。

6.根据权利要求5所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，其特征在于：步骤S1的具体方法为：含TrCel61A信号肽序列的DNA片段通过互补引物pTrS_f和 pTrS_r退火合成，再用限制性核酸内切酶BstBI 和 EcoRI酶切，连接到同样经过BstBI和 EcoRI酶切pPICZαA 载体中获得载体 pPICZ-TrS；其中，引物pTrS_f 和 pTrS_r序列分别为：

5’-cgaaATGATTCAAAAATTGTCTAACTTACTTGTTACTGCTTTGGCAGTTGCTACTGGTGTTGTGGGAg-3’，

5’-aattcTCCCACAACACCAGTAGCAACTGCCAAAGCAGTAACAAGTAAGTTAGACAATTTTTGAATCATtt-3’。

7.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa在降解纤维素和/或木质纤维素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa与纤维素酶系协同降解纤维素和/或木质纤维素。