[发明专利]抗PD-1纳米抗体的筛选及应用

说明书

本发明公开抗PD‑1纳米抗体的筛选以及应用。并且本发明还提供了抗PD‑1纳米抗体的决定簇互补区和框架区，编码PD‑1纳米抗体的核苷酸序列。本发明还提供了包含纳米抗体文库的构建方法以及抗PD‑1纳米抗体的筛选方法。筛选出来的该抗PD‑1纳米抗体可应用于分子检测，作为治疗多种肿瘤的方法。

技术领域

本发明设计纳米抗体文库的构建以及利用哺乳动物展示技术筛选医用抗PD-1纳米抗体与其应用研究。

背景技术

PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。肿瘤免疫治疗领域研究热点主要集中在抗程序性死亡-1（PD-1）受体等免疫检查点抑制剂上，它和传统的化疗和靶向治疗不同，主要是通过克服患者体内的免疫抑制，重新激活患者自身的免疫细胞来杀伤肿瘤，是一种全新的抗肿瘤治疗理念。

肿瘤的免疫逃逸机制与肿瘤微环境之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的杀伤，它不但要在体内激活原有的免疫系统反应，更要维持免疫系统反应的持续时间和反应强度。人体内T细胞的活化采取了两条信号通路的系统，即通过抗原呈递细胞MHC-抗原给细胞提供第一信号外，还需要一系列分子提供第二号，才能使T细胞产生免疫应答。这个双信号通路系统严格调控着机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答。肿瘤细胞通过高表达PD-L1与体内的T细胞表面的PD-1结合，弱化T细胞的杀伤能力，从而躲避T细胞的杀伤。因此，PD-1为一个行之有效的靶点，对其开发出相应的抗体是治疗此类肿瘤的有效手段之一。日前有多家跨国制药公司在研发针对PD-1的单克降抗体，通过阻断PDL1和PD-1之间相互左右，最大限度的提高患者自身对肿的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤。如Merck公司的PD-1单克隆抗体在临床结果中，在非小细胞肺癌、黑素瘤等癌症中都看到了一定的疗效。这表明PD-1抗体对肿有着积极疗效。

哺乳动物细胞展示系统为治疗性抗体的产生提供了许多潜在的优势，包括能够在细胞表面显示功能性糖基化IgGs的同时，选择与制造相关的关键特性，如高表达和稳定性。这种技术不仅能够展示全长抗体，还能够利用真核表达系统指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，并在哺乳细胞中稳定且高水平的表达分泌。因此哺乳细胞展示技术具有其他技术没有的潜在优势。

在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体的可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。纳米抗体的应用优势用于生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发)；用于临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法)；用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究等。纳米抗体的独特性质，使其在疾病的诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，如何构建纳米抗体文库并筛选出相应蛋白的纳米抗体，并用此纳米抗体有效治疗肿瘤。

为解决上述技术问题，本发明首先构建了CDR1,CDR2,CDR3随机氨基酸的纳米抗体文库。