[发明专利]一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法

权利要求书

1.一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法，其特征在于，步骤如下：

(1)金属有机骨架纳米片的制备：按照质量比为17:100配制氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入氢氧化钠，再搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入抗坏血酸，其中，氯化铜、氢氧化钠与抗坏血酸三者的摩尔比4:2:1，继续搅拌5-10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜纳米颗粒；随后，通过离心分离收集固体，用乙醇清洗清洗3-5次后，将固体再次分散到乙醇中，得到Cu₂O乙醇分散液；

先配制H₃BTC的乙醇溶液，再配制PVP和均苯三甲酸的水溶液，混合搅拌5-10min后，加入Cu₂O乙醇分散液，其中Cu、PVP和均苯三甲酸三者的质量比为64:4000:2000，1-2min内混合液变为透明颜色；继续搅拌2-5h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成金属有机骨架纳米片，混合液继续在室温下搅拌12-24h后，通过离心分离收集固体产物，然后分别依次用乙醇和高纯水离心清洗3-5次；将收集的固体粉末在25-50℃下真空干燥12-24h，得到浅蓝色粉末即为金属有机骨架纳米片，置于干燥条件下保存；

(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：取序列1氨基修饰的OTC适配体与等物质的量的序列2FAM标记的短链ssDNA在25-35℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至90-95℃，并保持5-10min，形成部分杂交的双链DNA探针；将金属有机骨架纳米片分散在MES缓冲溶液中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，其中金属有机骨架纳米片、EDC和NHS三者的最终质量比25:10:10，MES缓冲溶液的浓度为10-25mM，pH＝5-6；上述混合体系在25-35℃下磁力搅拌10-30min后，加入部分杂交的双链DNA探针，其中，双链DNA探针的摩尔量与金属有机骨架纳米片的质量比为1mol:10⁶g，混合物在25-35℃下搅拌12-24h后，用高纯水离心清洗清洗2-3次，收集固体产物，冷冻干燥12-24h得到DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片；

(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：将步骤(2)制备的DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片分散在HEPES溶液中，再加入PSS，混合液在25-35℃下孵化1-2h；其中，HEPES溶液的浓度为10-25mM，pH＝7-8；PSS在体系中的终质量浓度0.001％-0.5％wt；

(4)土霉素的定量检测：向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0-25μg/L的土霉素的HEPES溶液；在25-35℃下，孵化0.5-2h，测定反应体系荧光强度；其中，HEPES溶液的浓度为10-25mM，pH＝7-8；

所述的DNA序列如下：

序列1：5'-NH₂-C6-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CGA GGC ACA GTC GCT GGT GCC TACCTG GTT GCC GTT GTG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'

序列2：5'-FAM-CAC GTG GAG CTC GG-3'。

2.根据权利要求1所述的一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法，其特征在于，离心的条件为8000-10000r/min。