[发明专利]以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测特异性引物，其特征是，序列如下：

NS3-F：5’- GCTATGGGATGTGCCTGCTC -3’；

NS3-R：5’- TCCCTTCACCGCTTCTCA -3’。

2.以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒，其特征是，它包括如下成分：

1）寨卡病毒NS3基因的特异性引物

NS3-F：5’- GCTATGGGATGTGCCTGCTC -3’

NS3-R：5’- TCCCTTCACCGCTTCTCA -3’。

2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧

光染料；

3）寨卡病毒基因组；

4）ddH2O；

5）25 mM MgCl2。

3.以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测方法，其特征是，它包括如下步骤：

1）高分辨率熔解曲线模板寨卡病毒基因组RNA的制备

使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取寨卡病毒基因组RNA，

2）寨卡病毒基因组RNA逆转录成cDNA

使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明将寨卡病毒基因组RNA逆转录成cDNA，

3）高分辨率熔解曲线反应体系：

30μL反应体系包括：FastStart Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，NS3-F引物1μL，NS3-R引物1μL，反应缓冲液3 μL，25 mM MgCl₂3.6 μL，ddH2O 15.9 μL，

4）高分辨率熔解曲线反应程序：

94℃预变性5 min，94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min，

PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，95℃变性1min，40℃降温1min，65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号），40℃冷却10s，使用LightCycler® 480 GeneScanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线。