[发明专利]一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用

说明书

本发明提供了一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用。所述突变型猪圆环病毒2型病毒，是将PCV2d基因型野生毒株Rep蛋白的第6位由编码丝氨酸（S）的密码子突变为编码天冬酰胺（N）的密码子。本发明还构建了目的基因的双拷贝重组质粒，进一步转染获得了表达重组蛋白的PK‑15细胞系。通过载毒量和一步生长曲线法试验了该突变能够显著增强PCV2病毒在PK‑15细胞内的复制能力，能够提高细胞培养液中病毒的滴度。传至第10代仍可检测到PCV2d基因型的表达，且没有发生突变，能够进行稳定遗传。为PCV2疫苗的研制和高效工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物农业领域，具体涉及一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用。

背景技术

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知在哺乳动物细胞中能够自主复制的最小病毒。病毒粒子无囊膜，直径为15-25nm，表现出二十面体的对称性。病毒粒子包含一条单链闭环DNA，其大小范围约为1.7至2kb。根据猪圆环病毒的抗原性及基因组序列的差异，猪圆环病毒被分为三个基因型，即猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。PCV2于1998年从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的猪体内被分离到。PCV2已被公认为是猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）最重要的病原体，是影响当今全球养猪业最重要的疾病之一，造成严重的经济损失。

据预测PCV2可能具有11个开放阅读框（ORF），其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒正链上并按顺时针方向转录，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11由互补链编码并按逆时针方向转录。目前被证实的只有ORF1-6六个开放阅读框，其余阅读框编码情况尚未得到证实。其中ORF1和ORF2是PCV2主要的开放阅读框，尽管PCV2基因组精简，但PCV2通过滚环复制的方式，病毒复制时先产生双链复制型中间体，此复制型中间体的两条DNA链都可以进行转录和蛋白表达，导致决定其致病性或毒力的特定遗传因素难以捉摸。

ORF1位于PCV2基因组的51-995bp位置，是PCV2最大的ORF。ORF1主要编码2种蛋白（Rep和Rep’），Rep和Rep’都是PCV2复制所必需的。Rep蛋白目前被认为是PCV2的重要免疫原性蛋白，其在细胞介导的免疫中起重要作用，通过限制PCV2复制并阻止PCV2的感染向PMWS发展。Rep蛋白作为PCV2复制的关键蛋白，其氨基酸序列十分保守。但对比大量PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型 Rep蛋白氨基酸序列后，发现在3种基因型之间仍存在3个位点呈现规律性的变化，分别为第6位、第34位和第77位氨基酸上。这3个位点的改变是否会对病毒的复制和致病力产生影响目前尚不清楚，也没有相关研究报道。

因PCV2体外繁殖能力差，病毒感染细胞后增殖滴度低。这严重影响PCV2疫苗的规模化生产，且对PCV2灭活疫苗的免疫效果造成了一定影响。J. Li等报道（Differentiationof PCV1 and PCV2 by a multiplex real-time PCR assay. VETERINARY RECORD.2013），在进行PCV2分离培养过程中经常遇到PCV2在PK-15细胞培养中污染PCV1，且发现污染后连续传代3-5代PCV1就会成为优势毒株，影响PCV2的复制。因此，需要寻找一种能够增强PCV2增殖能力的方法。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种突变型的猪圆环病毒2型病毒，能够显著增强PCV2病毒在PK-15细胞内的复制能力，提高细胞培养液中病毒的滴度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种突变型猪圆环病毒2型病毒翻译的重组蛋白质，是将PCV2 SD毒株Rep蛋白的第6位由丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N），包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。所述PCV2SD毒株的GenBank登录号为JQ653449.1，核酸序列如SEQ ID NO: 2。