[发明专利]一种表达人促卵泡生长激素（FSH）的方法在审
| 申请号： | 201910373911.1 | 申请日： | 2019-05-07 |
| 公开（公告）号： | CN109957580A | 公开（公告）日： | 2019-07-02 |
| 发明（设计）人： | 李青旺;华荣茂;李媛 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/861 | 分类号： | C12N15/861;C07K14/59 |
| 代理公司： | 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) 11427 | 代理人： | 陈娟 |
| 地址： | 712100 陕西省咸阳*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 卵泡 人促 生长激素 动物乳腺 生长激素蛋白 上皮细胞 制备 体外生物活性 腺病毒感染 乳腺上皮细胞 腺病毒载体 动物泌乳 高效表达 目的基因 生产重组 转基因羊 等大 分泌 克隆 细胞 | ||
1.一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法，其特征在于，该方法是利用腺病毒载体在动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素，包括以下步骤：
(1)构建重组人促卵泡生长激素腺病毒载体
以pAdTrack-CMV为腺病毒穿梭载体，将人促卵泡生长激素基因克隆到pAdTrack-CMV载体构建pAdTrack-CMV-FSH腺病毒穿梭载体，腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-FSH与骨架载体pAdEasy-1通过转化到大肠杆菌体内重组后获得了重组腺病毒载体pAdEasy-FSH；
(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增
将重组腺病毒载体pAdEasy-FSH转染到人胚胎肾细胞中，10-14d后得到第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，收集第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，通过感染人胚胎肾细胞后继续扩增得到滴度更高的腺病毒，收集得到第三代重组人促卵泡生长激素腺病毒，测定第三代重组人促卵泡生长激素病毒的滴度；
(3)重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞
将重组人促卵泡生长激素腺病毒加入到培养了24-30h的动物乳腺上皮细胞中，24h-48h后收集动物乳腺上皮细胞蛋白；
(4)重组人促卵泡生长激素的鉴定及纯化
收集动物乳腺上皮细胞蛋白，通过蛋白质免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白的表达，利用亲合层析方法纯化动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素；
(5)重组人促卵泡生长激素活性检测
将动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素进行体外活性检测，验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性。
2.根据权利1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的人促卵泡生长激素基因是由由FSHα及FSHβ两个亚基基因组成；所述FSHβ目的基因后携带6个组氨酸标签基因，用于后期在动物乳腺上皮细胞表达的目的蛋白的纯化。
3.根据权利要求1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于：步骤(4)中所述Western blotting鉴定目的蛋白的表达，电泳过程中蛋白上样缓冲液为非还原上样缓冲液，蛋白样品不进行煮沸处理。
4.根据权利要求1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于，步骤(5)中所述验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性的方法为人促卵泡生长激素刺激含人促卵泡生长激素受体蛋白的HEK-293A细胞产生环磷酸腺苷(cAMP)，从而可以利ELISA试剂盒来测定含人促卵泡生长激素受体蛋白的HEK-293A细胞产生的环磷酸腺苷的浓度。
5.根据权利1-4任一所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于：步骤(3)中通过腺病毒载体表达的重组人促卵泡生长激素的目标宿主细胞为羊乳腺上皮细胞或者牛乳腺上皮细胞。
6.如权利要求1-4任一所述表达人促卵泡生长激素的方法生产的重组人促卵泡生长激素。
7.如权利要求6中所述的重组人促卵泡生长激素的应用。
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