[发明专利]醛酮还原酶BcAKR及其突变体和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BcAKR及其突变体和应用，所述突变体是由野生型腊样芽孢杆菌醛酮还原酶(Bacillus cereus aldo‑keto reductase,BcAKR)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BcAKR及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BcAKR及其突变体通过催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。本发明中的醛酮还原酶BcAKR及其突变体可以催化上述底物可以获取光学纯的手性醇，例如光学纯的(R)‑邻氯扁桃酸甲酯，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BcAKR及其突变体和应用，所述突变体是由野生型腊样芽孢杆菌醛酮还原酶(Bacillus cereus aldo-keto reductase,BcAKR)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BcAKR及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BcAKR及其突变体通过催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。

背景技术

氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(ADP)受体阻滞剂，可与血小板膜表面ADP受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板凝集，主要用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，在国内具有广泛市场。(R)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-Cl-C₆H₄CH(OH)COOCH₃，分子量为200.62，CAS号：32345-59-8)是合成氯吡格雷的重要手性中间体，可由相应的α-酮酸脂不对称还原得到。α-酮酸酯类化合物是一种结构简单而又特殊的化合物，具有两个羰基，还原得到的光学醇类化合物作为重要的合成中间体在化工与医药领域得到广泛的应用。光学活性手性醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，尤其生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视。

因此针对上述的化合物及其类似化合物，寻找一种羰基还原酶能够催化高底物浓度下的高立体选择性不对称还原，不添加或者添加极少量辅酶，经济易得，无疑具有极其重大的意义。已有文献报道利用醛酮还原酶进行高底物浓度催化的实例，如利用属醛酮还原酶的YtbE生成氯吡格雷中间体，底物浓度达500g/L(Tetrahedron Lett 2012,53(35):4715-4717)。

醛酮还原酶(Aldo keto reductases，AKRs)是一类依赖于NAD(P)⁺的氧化还原酶，包含了超过190个成员。其结构由(α/β)₈桶状结构及loop区构成，活性中心由loop 4、loop7及loop C组成，催化活性位点包括Tyr、Asp、Lys以及His。醛酮还原酶能够催化底物的类型包含多种，例如糖醛、类固醇、前列腺素、羰基化合物及酮酸酯类化合物等。来源于不同菌属中的醛酮还原酶可催化不同类型的底物得到相应的具有手性中心的氧化还原产物，一些野生状态下或经过蛋白质修饰后的的醛酮还原酶在手性药物中间体合成中得到了合理应用。目前已有10余个来源于不同菌属的醛酮还原酶被表征，因此，不论在学术领域还是在实际应用当中，醛酮还原酶都有着潜在的研究价值。

然而目前已有文献报道的具有高活性与立体选择性的醛酮还原酶仍占少数。最近已有通过蛋白质工程将自然界存在的醛酮还原酶进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，例如可通过对醛酮还原酶的loop区进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，但成功例子仍较少。因此发掘并且改造醛酮还原酶以提高其催化性能的需求较为迫切。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于蜡样芽孢杆菌的醛酮还原酶BcAKR，通过理性设计及蛋白质定向进化提高该酶的活性及立体选择性，实现光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

发明内容