[发明专利]一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记

说明书

一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，该SCAR标记为SC343‑1.4K‑12，在Genbank的序列号为MK584624，其制备步骤包括：S1、实验材料的采集和鉴定；S2、罗汉果DNA的提取；S3、构建DNA雌雄池；S4、RAPD引物筛选；S5、特异性片段的回收、克隆和测定；S6、SCAR引物的设计及特异性验证。本发明开发的罗汉果性别特异的SCAR标记(SC343‑1.4K‑12)，序列总长为22bp，在64℃退火条件下可稳定扩增出1373bp的雄性特异带，其特异性和稳定性要显著优于相应的RAPD引物S343(序列长10bp)，为罗汉果的性别早期鉴定和分子辅助育种提供了有效的途径。

技术领域

本发明涉及罗汉果性别鉴定领域，尤其涉及一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记。

背景技术

罗汉果是广西的著名特产，也是一种传统中药和保健食品，果实中的主要甜味成分罗汉果苷Ⅴ的甜度约为甜菊苷和甘草甜素的2倍和6倍，约为蔗糖的300倍左右，是迄今为止所知最甜的非糖类物质之一，且低热、无毒，是糖尿病和肥胖病人极为理想的食糖代用品，具有极高的应用价值和市场开发前景。

罗汉果为雌雄异株的植物，但性别在苗期难以鉴定，因而性别的早期鉴定是罗汉果育种中亟待解决的问题，而分子标记技术是解决该问题的一条行之有效的途径，但早期开发的罗汉果性别鉴定的分子标记主要为RAPD标记，虽然成本较低，使用方便，但由于该类型标记的序列过短(仅10bp)，因而特异性和稳定性相对较差，实用性不高，而在RAPD标记的基础上开发序列较长的SCAR标记(18-24bp)则可以有效地解决这些问题。

目前，尚未见有关罗汉果性别鉴定的SCAR标记的开发与使用的报道，为解决上述问题，本申请中提出一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记。

发明内容

(一)发明目的

为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，本发明在RAPD标记的基础上开发出一个稳定性和特异性更高的SCAR标记，为罗汉果的性别早期鉴定和辅助育种研究提供了分子依据。

(二)技术方案

为解决上述问题，本发明提供了一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，该SCAR标记为SC343-1.4K-12，其在Genbank的序列号为MK584624。

优选的，上述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记制备步骤包括：

S1、实验材料的采集和鉴定；采集罗汉果雌雄单株各30株，其性别均在开花后根据花器官的结构予以确定；

S2、罗汉果DNA的提取；称取罗汉果幼叶0.1g，在液氮中磨碎后提取其总DNA，接着采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性，最后进行DNA的定量检测。

S3、构建DNA雌雄池；将DNA稀释至统一浓度，-20℃保存备用；随机选择雌雄单株各10份，取等量DNA混匀构建DNA雌雄池；

S4、RAPD引物筛选；首先用雌雄池对所有的RAPD引物进行第一轮初筛，选择条带有差异的引物；接着利用雌雄单株各10份对其进行第二轮筛选，从中选择对应关系较好的引物；再对所有的雌雄单株进行第三轮筛选验证，最终得到一条雄性特异带；

其中RPAD-PCR反应体系为DNA模板1μl(100ng/μl)，RAPD引物1μl(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix(天根)10μl，加ddH₂O补足至20μl；

RAPD-PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min；