[发明专利]一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用在审

申请号：	201910375749.7	申请日：	2019-05-07
公开（公告）号：	CN109943662A	公开（公告）日：	2019-06-28
发明（设计）人：	王志贤;阎香言;盛长忠;周泽奇;粟艳	申请（专利权）人：	丹娜（天津）生物科技有限公司
主分类号：	C12Q1/6895	分类号：	C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/68;C12R1/67;C12R1/685;C12R1/66
代理公司：	北京品源专利代理有限公司 11332	代理人：	巩克栋
地址：	300467 天津市滨海新区生态城中天大道2***	国省代码：	天津;12
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摘要：
搜索关键词：	引物探针种检测黄曲霉互补探针检测探针黑曲霉曲霉菌试剂盒土曲霉烟曲霉霉菌种曲特异性引物互补配对一次检测荧光通道检测应用感染
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【权利要求书】：

1.一种曲霉菌分种检测的引物探针组合，其特征在于，包括分别针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的特异性引物、检测探针以及互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述烟曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述黄曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述黑曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述土曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

优选地，所述烟曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，黄曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，黑曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，土曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

优选地，所述烟曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，黄曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，黑曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，土曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

优选地，所述引物探针组合还包括内参系统；

优选地，所述内参系统包括内参引物和内参探针；

优选地，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；

优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的检测探针的3’端修饰有淬灭基团，5’端修饰有荧光基团；

优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任一种或至少两种的组合；

优选地，所述检测探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合；

优选地，所述互补探针的3’端修饰有淬灭基团；

优选地，所述互补探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。

4.一种曲霉菌分种检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；

优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

优选地，所述阳性质控分别为含有烟曲霉DNA片段的质粒、含有黄曲霉DNA片段的质粒、含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒；

优选地，所述烟曲霉DNA片段、黄曲霉DNA片段、黑曲霉DNA片段和土曲霉DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；

优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO和缓冲液；

优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl；

优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM；

优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM。