[发明专利]一种高质量水稻核糖体印记文库的构建方法

权利要求书

1.一种改良的核糖体提取液配方，其特征在于，包括如下组分：

0.05～0.15M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；

30～50mM的氯化钾(KCl)；

10～30mM的氯化镁(MgCl₂)；

1.5～2.5％(V/V)的聚氧乙烯(10)十三烷基醚(polyoxyethylene(10)tridecylether)；

0.1～0.3％(W/V)的脱氧胆酸(deoxycholic acid)；

0.5～1.5mM的二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)；

50～100μg/mL的放线菌酮(cycloheximide)；

以及5～15U/mL的脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)。

2.一种水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，从水稻材料中，通过改良的核糖体提取液分离出核糖体/RNA样品；

S3，对核糖体/RNA样品进行核酸酶处理、SDS法抽提，得到水稻核糖体印记RNA片段；

S4，去除水稻核糖体印记RNA片段中的rRNA；

S5，对水稻核糖体印记RNA片段的末端进行修复；

S6，将水稻核糖体印记RNA片段与3′端接头序列连接；

S7，通过反转录获得水稻核糖体印记DNA文库；

S9，对核糖体印记DNA文库进行环化及PCR富集。

3.根据权利要求2所述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，在上述任一个步骤结束后，还包括对中间产物进行纯化的步骤。

4.根据权利要求3述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S3中，核酸酶处理具体是：采用15～40U核酸酶/40μg RNA的比例向核糖体/RNA样品中加入核酸酶，室温条件下金属浴、600～800rpm震荡处理1～2小时。

5.根据权利要求4述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S3中，对核糖体/RNA样品进行核酸酶处理、SDS法抽提；然后用纯化富集试剂盒进行纯化及富集操作，此时，样品加入滤芯进行过滤以及用无RNA酶水从滤芯上洗脱结合的核酸样品，重复过柱数次。

6.根据权利要求5述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S3中，用纯化富集试剂盒进行纯化及富集操作包括以RNA纯化富集试剂盒R1017纯化核糖体印记RNA的操作，该操作包括：样品过柱完成后，向滤柱中加入400μL RNA洗涤缓冲液，室温下12000～16000g离心30秒～1分钟，舍弃滤液，向滤柱中加入80μL DNaseI处理液，所述DNaseI处理液具体包括5μL DNaseI和75μL DNaseI缓冲液，室温静置15～20分钟。

7.根据权利要求2述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S4，具体是：采用rRNA去除试剂盒去除核糖体印记RNA中的rRNA。

8.根据权利要求7述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S4，具体包括：

S41，准备纯化用的rRNA去除磁珠；

S42，对RNA样品进行预处理；

S43，对RNA样品中rRNA进行去除；

S44，对核糖体印记RNA样品进行过柱纯化；

S45，对核糖体印记RNA样品进行PAGE纯化。

9.根据权利要求8述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S45，PAGE纯化核酸样品时，凝胶样品置于旋转混匀器、低温下20～40rpm旋转过夜；利用0.45μm孔径的滤柱分离凝胶。

10.根据权利要求8述的水稻的高质量核糖体印记文库的构建方法，其特征在于，S9之后还包括S10，在完成核糖体印记DNA文库富集后，对核糖体印记DNA文库再次纯化，具体包括：

S101，DNA结合磁珠纯化；

S102，Native PAGE纯化，具体的：Native PAGE纯化PCR产物，切取核糖体印记文库胶块，研碎后，重悬于400μL 0.4N NaCl溶液；过滤；向滤液中加入2μL糖元、40μL 3M醋酸钠(pH5.2)和1mL无水乙醇，进行沉淀。