[发明专利]一种预血管化的双相人工骨支架及其制备方法

说明书

本发明提出一种预血管化的双相人工骨支架及其制备方法，支架由复合间充质干细胞和血管内皮细胞的凝胶相，及多孔结构的生物陶瓷相组成。凝胶相有利于血管内皮细胞发育成毛细血管结构，羟基磷灰石相支架为间充质干细胞提供锚定位点，利于成骨分化。使用3D打印制备羟基磷灰石相多孔支架，然后配置复合间充质干细胞和血管内皮细胞纤维蛋白溶液，将支架浸没于纤维蛋白溶液并加入凝血酶固化，得到复合细胞双相活性支架，培养后得到带有血管网络活性支架。该支架植入后，内皮细胞形成毛细血管样结构能快速与宿主血管建立连接，还能刺激周围组织天然毛细血管快速生长进入支架内，保证支架内部细胞营养供应，且能持续提供干细胞和生物活性因子，实现骨缺损高效修复。

技术领域

本发明涉及骨组织工程领域，具体是指一种体外预血管化的纤维蛋白凝胶/羟基磷灰石双相人工骨支架及其制备方法。

背景技术

由创伤、肿瘤等导致的骨缺损一直是治疗的重点及难点，临床上通常采用自体、同种异体或异种骨移植等方式进行修补。然而自体骨来源不足，术后并发症多；异体骨与宿主骨的结合能力较弱，有抗原特性，会因剧烈的免疫排斥反应导致植入失败，且存在潜在的疾病传播可能性，临床应用能力有限。骨组织工程学的发展提供了一种新的解决途径，其核心是建立由细胞/活性因子/骨支架构成的空间复合体，植入缺损部位促进骨的修复和再生。其中骨支架为细胞提供停泊、代谢和物质交换的场所，是形成新的有特定形态和功能的骨组织的物质基础。

为加速骨再生，种子细胞被预先接种在支架内，并在植入前进行体外培养。然而种子细胞的存活需要充足的血液供应以保证代谢所需的营养交换。对于修复大段骨缺损，若支架植入体内之前未建立血管网体系，植入后外源性血管侵入速率约为200μm/天，完全建成血管网络之前需要经历较长时间的血管化过程，在此期间只有支架表层的细胞能够通过扩散作用从周围的组织中获取氧气和营养物质，而支架内部会由于缺氧和营养不足形成细胞坏死区，增加了移植失败的风险。同时完整的血管网络能够持续为局部组织提供活性因子和干/祖细胞，大大增加了骨修复效率。因此建立预血管化的组织工程骨，并迅速完成该预成型血管网络与支架外周血管之间的对接，是解决组织工程骨支架存活率的首要问题。现阶段血管化支架的研究主要集中在优化支架空间结构以利于可溶性因子的渗透；对支架表面进行修饰，使之更利于细胞的趋化、黏附、增殖；构建活性因子的控释系统，模拟生理条件下组织修复再生各阶段中促血管生成物质释放的量及过程等方面，未见有体外构建具有成型血管网络的活性支架制备工艺。

为实现支架的预血管化，种子细胞的选择非常重要。血管内皮细胞能够发育成血管，而间充质干细胞有成骨分化的能力。同时内皮细胞和间充质干细胞的共同培养，能够促进微血管网的形成(Chen Y C,Lin R Z,Qi H,et al.Functional Human VascularNetwork Generated in Photocrosslinkable Gelatin Methacrylate Hydrogels[J].Advanced Functional Materials,2012,22(10))。内皮细胞在胶原蛋白、壳聚糖、纤维蛋白等生物聚合物诱导成型的软凝胶中能够自发形成毛细血管结构，且凝胶内部的网络结构利于细胞的迁移，但间充质干细胞的成骨分化需要坚硬的基质提供锚定位点，而现有的单相支架不能同时满足成骨分化和成血管的需要。羟基磷灰石是自然骨中的主要无机成分，具有极佳的生物相容性和骨诱导特性，且成型后的支架机械强度高，利于间充质干细胞的黏附和成骨分化。

发明内容

为解决骨支架的血管化问题，本发明提出一种预血管化的双相生物活性人工骨支架及其制备方法。实现成型血管网络的体外构建，使之能够在植入缺损部位后的短时间内与宿主外周血管建立连接，保证支架内部种子细胞的营养供给，同时为支架持续提供生物活性因子和干细胞，实现骨缺损的高效修复。

本发明的技术方案为：