[发明专利]一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物和方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物和方法。所述引物包括正向引物和互补引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，该方法利用所述的引物进行未知RNA真菌病毒基因组克隆可获得未知病毒dsRNA全长cDNA序列。本发明中设计的正向引物是根据血苋类病毒序列设计，与已知真菌和植物病毒序列没有相似性，避免了扩增病毒序列时的非特异扩增；同时该接头序列比已知接头引物序列短，连接效率高；在病毒基因组扩增过程中反转录除了加入互补引物以外还加入了随机引物，可以保证病毒基因组反转录更完全，适应于真菌病毒RNA基因组的扩增，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物和方法。

背景技术

病毒根据寄主的不同可分为植物病毒、动物病毒、噬菌体和真菌病毒等。真菌病毒广泛存在于病原真菌中，大多呈现无症状的潜伏侵染不引起寄主表型变化。有的真菌病毒对寄主真菌产生有益的作用，如引起寄主致病力增强或增强寄主真菌寄和植物的耐热性。少数真菌病毒能引起寄主表型变化，包括引起寄主致病力衰退等。弱毒相关真菌病毒可作为潜在的生防因子用于植物真菌性病害防治。同时，真菌病毒与寄主真菌的互作系统对了解病毒和真菌致病性提供了一个良好的模型和工具。除此之外，自然界中存在丰富的真菌病毒资源，大部分的真菌病毒具有多样性的分子特性和生物学特征。所以新真菌病毒的发现有助于提高对整个病毒进化和生态的了解，对推动病毒学的发展具有重要的意义。获得病毒全基因组序列，是解析病毒的基因组结构和进化关系以及研究病毒基因功能的关键步骤。

大部分病毒具有RNA的基因组，包括dsRNA和ssRNA病毒，ssRNA病毒在复制过程中有一段dsRNA形式的复制中间体，所以真菌内dsRNA和ssRNA病毒都可以通过提取dsRNA获得。常规的病毒检测和测序的方法包括，从培养的真菌内分离到病毒粒子和核酸，通过随机引物合成和建立cDNA文库，通过设计特异性引物补平cDNA文库获得的片段间隙，最后通过RACE方法确定末端序列，或者用单引物扩增法获得dsRNA的末端序列，即先在dsRNA的3'-OH端加上一段5’端被磷酸化，3’端被氨基化的接头序列，接着用与接头互补的引物进行逆转录，并用已获得的dsRNA序列设计特异性引物和与接头互补的引物进行PCR扩增获得末端序列。这些方法步骤较多，比较繁琐，需要经过中间引物设计阶段，因此有必要开发出一种效率更高的扩增病毒RNA全长cDNA序列的方法。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物和方法，能快速获得真菌病毒dsRNA全长cDNA序列，以解决目前常规的真菌病毒检测和测序方法步骤较多，较为繁琐的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物，所述引物包括正向引物和互补引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述互补引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

进一步地，所述正向引物与已知病毒序列无同源性，且5’端磷酸化，3’端氨基化。

进一步地，所述未知RNA真菌病毒包括双链RNA病毒和单链RNA病毒。

一种利用所述的引物进行未知RNA真菌病毒基因组克隆的方法，包括以下步骤：

(1)真菌病毒dsRNA的提取；

(2)利用连接酶将所述正向引物与dsRNA进行连接，并将连接产物进行纯化；

(3)以所述连接产物为模板，利用所述互补引物和随机引物进行反转录合成cDNA第一链；

(4)以所述cDNA第一链为模板，以所述互补引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(5)对PCR扩增产物进行克隆测序。