[发明专利]一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒

权利要求书

1.一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1-KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2-DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3-NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4-GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，筛选配对夹心抗体对；包括预包被特异性抗原表位1单抗的96孔酶标板、N8阳性样品、阴性对照、辣根过氧化物酶标记抗原表位4抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所特异性抗原表位1单抗，用包被液稀释浓度至5微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗体的酶标板；取待测样品加入包被孔，分别以N8重组蛋白作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP-特异性抗原表位4 IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。

2.如权利要求1所述的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：重组禽流感病毒H5N8亚型神经氨酸酶抗原，禽流感病毒H5N8亚型的神经氨酸酶核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得血凝素基因，将该基因克隆于大肠杆菌原核表达载体并转化入宿主细胞后，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导表达并纯化获得神经氨酸酶蛋白抗原。

3.如权利要求1所述的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗原的夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述酶标板分别预先包被5微克/毫升H5N8神经氨酸酶抗原表位1单抗作为捕获抗体，包被液为碳酸盐缓冲液，然后用1％的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液进行封闭、晾干备用。

4.如权利要求1所述的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗原的夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述夹心抗体为5000稀释的HRP-特异性抗原表位4 IgG。

5.如权利要求1所述检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗原的夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述阳性样品是序列明确重组的H5N8蛋白，阴性血清是未被H5N8感染的正常人血清。

6.如权利要求1所述检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗原的夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述试剂盒应保存在-4℃，避免溶剂的反复冻融，同时显色液应避光保存。

7.如权利要求1所述的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性抗原的夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述试剂盒能够特异性地识别样本中的H5N8神经氨酸酶特异性抗原位点。