[发明专利]一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用，属于病原诊断技术领域，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫。其中胶体金垫内有胶体金标记的抗葡萄球菌延长因子Tu（EFTu）抗原的单克隆抗体1F7F10；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对葡萄球菌EFTu另一表位的单克隆抗体2E5D3，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。本发明建立的胶体金免疫层析试纸条具有方便、快速、特异等优点，可用于葡萄球菌的快速检测。

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用。

背景技术

葡萄球菌引起的奶牛乳房炎是常见的奶牛疾病之一，从临床病例中分离最多的是凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，近些年发现不同种凝固酶阴性葡萄球菌所占的比重越来越高。对该类型疾病的诊断主要：①传统的细菌分离、培养、鉴定，该方法准确性较高，但耗时长；②鉴别培养基或显色培养基培养鉴定，该方法主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定，易受操作人员影响。我们在前期诊断研究中曾建立葡萄球菌增菌培养结合刃天青还原反应的奶牛乳房炎葡萄球菌微孔显色的诊断方法，该方法操作简便，也有较高的检测灵敏度，但易受到乳汁中白细胞及上皮细胞裂解后释放出的酶影响；③免疫学方法检测，如凝集试验、免疫荧光光试验、ELISA等，此类方法目前仍然集中于金黄色葡萄球菌的诊断，而且对实验人员要求较高；④核酸检测，如PCR检测16S rRNA、Tuf、Coa、Nuc基因及序列测定等，该方法可有效鉴别所有的葡萄球菌，但存在检测技术要求高，确诊周期长等缺点，在一般的奶牛场难以开展；而基因芯片技术灵敏度高、特异性强，但主要检测对象是还是金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌的检测方法基本没有快速、高效、简便的方法。

胶体金免疫层析技术因其简便、快捷、易操作的特点，在疾病的检测、诊断上使用越来越广泛。目前已有不少关于葡萄球菌检测胶体金试纸条报道，如检葡萄球菌的SPA抗原检测试纸条、检测肠毒素A的试纸条等，这些试纸条主要用于金黄色葡萄球菌的检测，由于SPA并非所有的金黄色葡萄球菌都能表达，从而造成漏检现象发生，而肠毒素的检测往往用于葡萄球菌造成的食物中毒检测，难以用于葡萄球菌引起奶牛乳房炎的诊断。结合引起奶牛乳房炎葡萄球菌的流行病学特点，筛选出葡萄球菌共同的、特异的、标志性抗原，在此基础上开发出胶体金检测试纸，有着重要的意义。

发明内容

为了简便、快速、鉴定葡萄球菌性奶牛乳房炎，本发明提供一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种检测葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸(即一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸)，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫。其中胶体金垫内有胶体金标记的抗葡萄球菌延长因子Tu(EFTu)抗原的单克隆抗体1F7F10；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对葡萄球菌EFTu另一表位的单克隆抗体2E5D3，质控线为羊抗小鼠IgG抗体(浓度1.5mg/mL，羊抗小鼠IgG(H+L)抗体:购于杭州华安生物科技有限公司，CatNo.G006-1)。

单克隆抗体1F7F10针对的抗原表位均位于葡萄球菌EFTu特有的氨基酸序列NH₃-GTDADAASVREVFMKLGYKVKLNNDL-COOH中；单克隆抗体1F7F10和2E5D3与不同种葡萄球菌EFTu均能发生抗原-抗体反应，单克隆抗体1F7F10、2E5D3针对葡萄球菌EFTu不同表位。