[发明专利]一种筛选水稻突变体的方法

权利要求书

1.非疾病诊断目的的鉴定生物目标DNA片段突变的方法，包括：

1）利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段，得到富集的目标DNA片段；所述利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段包括利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1）、a2）和a3）：

a1）所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数，2≤n≤30；

a2）所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50%，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；

a3）所述成套引物中的每个引物对的9个因素中的A、B、C、D、E、F、G、H均在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；

所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；

所述因素B为引物对的反向引物的TM值，

所述因素C为目标片段的GC含量；

所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；

所述因素E为目标片段的结构自由能；

所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；

所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；

所述9个因素的标准范围如下：

35%≤所述因素A≤60%；

68℃≤所述因素B≤79℃；

30%≤所述因素C≤70%；

30%≤所述因素D≤70%；

15 kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70 kcal/mol；

所述因素F的绝对值＜100 kcal/mol；

所述因素G的绝对值＜100 kcal/mol；

4 kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10 kcal/mol；

所述因素I＜100℃；

所述PCR扩增所用DNA聚合酶为Q5 DNA聚合酶；

所述成套引物的每条引物在所述PCR扩增的体系中的浓度为0.088 pmol/μL；

所述PCR扩增的循环数为20；

2）对所述富集的目标DNA片段测序，得到待测生物目标DNA片段序列；

3）比较所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列，确定所述待测生物目标DNA片段是否发生突变：所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列相同，所述待测生物目标DNA片段未发生或候选未发生突变；所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列不同，所述待测生物目标DNA片段发生或候选发生突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述成套引物中各引物对的正向引物含有相同的序列，记为正向引物共同序列；各引物对的反向引物含有相同的序列，记为反向引物共同序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述正向引物共同序列的长度为h1）或h2）：

h1）15-25nt；

h2）21nt；

和/或，所述反向引物共同序列的长度为i1）或i2）：

i1）15-25nt；

i2）16nt。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述利用多重PCR富集目标DNA片段的方法还包括利用第二轮PCR引物对所述PCR产物1进行PCR产物进行扩增实现目标DNA片段的富集，将得到的PCR产物记为PCR产物2；所述第二轮PCR引物的两条引物分别含有所述正向引物共同序列和所述反向引物共同序列。