[发明专利]一种多重PCR方法

权利要求书

1.多重PCR方法，包括：利用成套引物进行PCR扩增，实现多重PCR；所述成套引物满足如下a1）、a2）和a3）：

a1）所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数，15≤n≤20；

a2）所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50%，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；

a3）所述成套引物中的每个引物对的9个因素中的A、B、C、D、E、F、G、H均在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；

所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；

所述因素B为引物对的反向引物的TM值，

所述因素C为目标片段的GC含量；

所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；

所述因素E为目标片段的结构自由能；

所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；

所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；

所述9个因素的标准范围如下：

35%≤所述因素A≤60%；

68℃≤所述因素B≤79℃；

30%≤所述因素C≤70%；

30%≤所述因素D≤70%；

15 kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70 kcal/mol；

所述因素F的绝对值＜100 kcal/mol；

所述因素G的绝对值＜100 kcal/mol；

4 kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10 kcal/mol；

所述因素I＜100℃；

所述PCR扩增所用DNA聚合酶为Q5 High-Fidelity 2X Master Mix中的DNA聚合酶；

所述成套引物的每条引物在所述PCR扩增的体系中的浓度为0.088 pmol/μL；

所述PCR扩增的循环数为20。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为e1）或e2）：

e1）58-65 ℃；

e2）60 ℃。

3.多重PCR引物的制备方法，包括：制备满足权利要求1中所述a1）、所述a2）和所述a3）的成套引物，得到用于多重PCR的引物。

4.权利要求1-3中任一所述方法在对生物基因组进行多重PCR扩增中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述方法在构建DNA测序文库中的应用。

6.权利要求1-3中任一所述方法在DNA测序中的应用。

7.权利要求1-3中任一所述方法在筛选基因组突变位点中的应用。

8.权利要求1-3中任一所述方法在筛选生物突变体中的应用。