[发明专利]一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法

说明书

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。其包括间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，该方法不仅可提高外泌体产量，而且所得到的外泌体具有纯度高、粒径适当等特点。该方法操作简单、成本低，适合大量提取外泌体，有利于临床应用，对应用间充质干细胞外泌体治疗临床疾病有重大意义。

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。

背景技术

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清中，是细胞核内体(也称多囊泡体)与细胞膜融合后释放到细胞外的直径为30-150nm，密度为1.10～1.18g/ml的膜性囊泡。外泌体可以通过向靶细胞运输各种生物活性分子如蛋白质、mRNA和miRNA等方式改变靶细胞的基因调控网络^[5]。

胎盘间充质干细胞的外泌体(MSC exosomes)可以增强血管再生，对缺血性疾病的治疗有奇异的效果。间充质干细胞的外泌体可以激活VEGF的受体，可加速下肢缺血组织的恢复。miR-320调控内皮生长因子(VEGF),成纤维生长因子(FGF)产生以干预糖尿病血管内皮细胞凋亡。^[6]Prakash等^[7]报道干细胞外泌体通过miRNA-210-3p刺激VEGF受体基因高表达及激活SRC,AKT,ERK等促血管生成通路，以起到大量分泌VEGF，最终改善微循环。

现有间充质干细胞来源的外泌体可以通过收集间充质干细胞上清来获取，主要提取方法有超速离心法、凝胶色谱法、超滤法、免疫磁珠法和试剂盒提取法。

干细胞分泌的外泌体(Exosomes)作用巨大，但尚未大规模应用临床，主要原因是其产量低下，无法满足临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。该方法不仅可提高外泌体产量，而且所得到的外泌体具有纯度高、粒径适当等特点。该方法操作简单、成本低，适合大量提取外泌体，有利于临床应用，对应用间充质干细胞外泌体治疗临床疾病有重大意义。

本发明所采用的技术方案为：一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其包括

间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，其具体步骤如下：

步骤一：脐带间充质干细胞培养基配比如下：100ml DMEM/F12培养基+2ml非必须氨基酸+2ml L-谷氨酰胺+2ug VCAM1试剂；

步骤二：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1分钟内快速解冻；

步骤三：无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5分钟，吸弃离心后上清；

步骤四：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数及活率检测；

步骤五：根据细胞数量及活率，用培养基调整细胞接种密度为1.0×105个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器皿上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养；

步骤六：观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80-90％时，可进行传代处理；

步骤七：在4℃下进行外泌体分离：48小时后提取细胞上清离心，分别应用1500rpm离心5分钟，2000g离心10分钟，10000g离心20分钟；

步骤八：最后，通过Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以100000g超速离心120分钟来分离外泌体。收集沉淀的外泌体，并重悬于无菌PBS中；

步骤九：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化外泌体。将外泌体储存在-80℃。