[发明专利]一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途有效
申请号: | 201910382569.1 | 申请日: | 2019-05-09 |
公开(公告)号: | CN110029096B | 公开(公告)日: | 2023-05-12 |
发明(设计)人: | 黄诗圣;李向阳;黄行许 | 申请(专利权)人: | 上海科技大学 |
主分类号: | C12N9/22 | 分类号: | C12N9/22;C12N9/78;C12N15/55;C12N15/90 |
代理公司: | 上海光华专利事务所(普通合伙) 31219 | 代理人: | 严晨;许亦琳 |
地址: | 201210 上*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 嘌呤 碱基 编辑 工具 及其 用途 | ||
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途。本发明提供一种融合蛋白,包括ecTadA‑ecTadA*二聚体片段和SpCas9‑NG D10A nickase片段,所述ecTadA‑ecTadA*二聚体片段包括ecTad片段和ecTadA*片段。本发明所提供的融合蛋白可以以NG为PAM序列,将sgRNA 5’端4‑7位的A突变为G,可以增加碱基编辑的靶向位点,此外,所述融合蛋白还具有编辑精准性高、邻近脱靶低等优点,具有良好的产业化前景。
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途。
背景技术
CRISPR/Cas9是目前应用最为广泛的基因编辑技术。在sgRNA的引导下Cas9到达指定区域发挥酶切活性,对PAM上游3bp和4bp间进行切割。CRISPR/Cas9切割后造成DNA的双链断裂(DSB),激发自身的DNA修复机制,主要分为HDR(Homologous Directly Repair,同源重组修复)和NHEJ(Non-Homologous End Join,非同源重组末端修复)。HDR可利用模板进行准确修复,NHEJ修复的结果随机引入插入或缺失,NHEJ在修复过程中占主要地位。
CRISPR/Cas9的出现使得基因操作非常便捷,但通过NHEJ随机引入插入或缺失并不能实现对基因组的精准编辑,而切割后提供同源重组的载体或者单链DNA(Single-stranded Donor Oligonucleotide,ssODN)的方法,效率低且耗费大量时间。而且Cas9切割造成的DSB可能引起基因组的大片段缺失,留下安全隐患。
哈佛大学的David Liu等报道使用RuvC结构域失活的Cas9D10Anickase(nCas9)融合脱氨酶的方法可以实现对基因组单碱基进行点突变(C-to-T或A-to-G),且不造成DSB,有胞嘧啶碱基编辑工具(Cytosine Base Editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑工具(Adenine BaseEditor,ABE)两种。
胞嘧啶脱氨酶/腺嘌呤脱氨酶和nCas9的融合蛋白在sgRNA的引导下到达靶向位点并与sgRNA互补的DNA链进行结合。胞嘧啶脱氨酶对周边一定范围的胞嘧啶C进行脱氨成为尿嘧啶U,U可以与腺嘌呤A互补配对,经过DNA的复制,U最终会被A的互补配对碱基T所取代;类似的,腺嘌呤脱氨酶对周边一定范围的腺嘌呤A进行脱氨成为次黄嘌呤I,I可以与胞嘧啶C互补配对,经过DNA的复制,I最终会被C的互补配对碱基G所取代。从而达到C-to-T或A-to-G的目的。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明一方面提供一种融合蛋白,包括ecTadA-ecTadA*二聚体片段和SpCas9-NG D10A nickase片段,所述ecTadA-ecTadA*二聚体片段包括ecTad片段和ecTadA*片段。
在本发明一些实施方式中,所述ecTadA片段的氨基酸序列包括:
a)如SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列;或,
b)与SEQ ID NO.57具有80%以上序列相似性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能,优选为能够与ecTadA*片段形成二聚体、且二聚体具有腺嘌呤脱氨酶活性。
在本发明一些实施方式中,所述ecTadA*片段的氨基酸序列包括:
c)如SEQ ID NO.58所示的氨基酸序列;或,
d)与SEQ ID NO.58具有80%以上序列相似性的氨基酸序列、且具有c)所限定的氨基酸序列的功能,优选为能够与ecTadA片段形成二聚体、且二聚体具有腺嘌呤脱氨酶活性。
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