[发明专利]一种固定水稻杂种优势的方法

权利要求书

1.一种固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将OsMADS13启动子与水稻BBM1基因编码序列连接，构建到表达载体中得到载体A；所述OsMADS13启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述水稻BBM1基因编码序列如SEQ IDNO.4所示；构建EAC1-like双靶点CRISPR/Cas9敲除的载体B；

S2、将所述载体A和所述载体B通过农杆菌介导法共转化到杂交水稻种子中得到T0代植株；

S3、筛选EAC1-like基因双等位纯合敲除同时成功异位表达BBM1基因的T0代植株，进行自交得到自交种子。

2.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述载体A的获得方法具体为：

S1-A1、根据OsMADS13基因的启动子序列设计引物seq1F和seq1R，以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物1；

S1-A2、根据BBM1基因编码区序列设计引物seq3F和seq3R，以水稻愈伤组织cDNA为模板，进行PCR扩增得到扩增产物2；

S1-A3、将所述扩增产物1和所述扩增产物2混合做为模板，利用所述引物seq1F和所述引物seq3R进行PCR扩增，得到扩增产物1和扩增产物2整合后的扩增产物3；

S1-A4、将所述扩增产物3连接至表达载体中得到载体A。

3.根据权利要求2所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述引物seq1F的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物seq1R的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述引物seq3F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述引物seq3R的序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述载体B的获得方法具体为：

S1-B1、根据EAC1-like基因编码区序列设计靶标序列；

S1-B2、构建含有所述靶标序列片段的CRISPR/Cas9重组载体B。

6.根据权利要求4所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S1-B1中所述靶标序列包括seq5和seq6，所述seq5的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，所述seq6的DNA序列如SEQ ID NO.9所示。

7.根据权利要求1所述的固定水稻杂种优势的方法，其特征在于，所述S3中筛选同时敲除EAC1-like基因与成功异位表达BBM1基因的T0代转基因植株的方法包括以下步骤：

S3-1、设计引物对seq8F和seq8R，所述Seq8F的序列如SEQ ID NO.10所示，所述Seq8R的序列如SEQ ID NO.11所示；对T0代转基因植物进行扩增，筛选成功扩增了载体A的阳性转基因植株；

S3-2、设计引物对seq9F和seq9R，所述Seq9F的序列如SEQ ID NO.12所示，所述Seq9R的序列如SEQ ID NO.13所示；对所述成功扩增了载体A的阳性转基因植株进行PCR扩增，筛选EAC1-like基因双等位纯合突变株系。