[发明专利]基于DNA和RNA基因突变检测的高通量方法

说明书

本发明公开基于DNA和RNA基因突变检测的高通量方法，其包括(1)利用试剂由从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，基于脱氧核糖核酸构建DNA文库；对于核糖核酸，先逆转录成双链cDNA，然后构建成为RNA文库。(2)使第一探针组与DNA文库混合，同时使第二探针组与RNA文库混合。(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；(4)利用高通量技术对复合体中靶标核酸进行测序。本发明采用基于NGS的方法学并对其进行优化，进一步提升检测的特异性和灵敏度。另外，通过针对RNA的检测还可以对DNA的检测结果进行验证。

技术领域

本发明涉及基因检测，具体涉及基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法。

背景技术

肿瘤等疾病往往伴有多种体细胞突变，这些突变被用于肿瘤监测、预后等生物指标，或靶向药物的靶点以及反应性标志。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。目前常见的肿瘤体细胞检测方案是DNA靶向测序或DNA靶向测序结合荧光定量PCR(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)等其他辅助手段来进行融合检测。

在检测体细胞变异时，研究人员目前大多选择靶向测序方案，明显缩小了测序的成本，也减轻了数据分析的负担。但目前针对体细胞变异中的融合检测，因为融合基因的断点一般都在内含子区域内，内含子一般比较长且包含不适合探针设计的区域，如简单，串联重复序列，转座子等，如果单独检测DNA，探针的设计会比较困难并会影响到捕获效率，同时考虑到融合基因在总DNA样品的丰度和背景基因组的比例偏低，会导致检出率偏低或漏检风险。同时对测序深度的要求也使得检测费用偏高，分析难度也比较大。

发明内容

本发明通过针对目标基因设计针对DNA部分的探针和针对RNA部分的探针，形成两个探针组。对生物样品进行DNA、RNA的共提取或分别提取，并分别测定DNA、RNA的含量和比例，共同建库或分别建库再按照比例混合，针对靶基因进行探针设计，优化并调整DNA和RNA捕获的探针组以及特定区域探针比例，并进行共同捕获后上机测序。由此解决了现有技术中的至少部分技术问题。另外，本发明使用RNA并行做捕获检测，设计相对简化，找出异常的外显子拼接组合，同时异常融合转录本的表达丰度较高会大大提高检出的概率。

本发明提供基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其对NGS的方法学进行优化，进一步提升检测的特异性和灵敏度。具体地，本发明包括以下内容。

一种基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其包括至少以下步骤：

(1)利用试剂从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，基于所述脱氧核糖核酸构建DNA文库，并基于所述核糖核酸构建RNA文库；

(2)使第一探针组与所述DNA文库在适于核酸结合的条件下混合，使第二探针组与所述RNA文库在适于核酸结合的条件下混合，同时调整第一探针组的量和/或第二探针组的量或两者的比例，其中，所述第一探针组为针对第一目标基因信息的至少一种探针，所述第二探针组为针对第二目标基因信息的至少一种探针；

(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；和

(4)利用高通量技术对所述复合体中的靶标核酸进行测序。

在某些实施方案中，所述生物样品包括选自体液、组织液和细胞或细胞群组成的组中的至少一种。

在某些实施方案中，步骤(1)中从同一生物样品同时提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，得到总核酸，并且利用所述总核酸构建得到DNA和RNA混合文库。