[发明专利]一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法

说明书

本发明公开了一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法。该方法在连续灌服7天含160μg/ml黑灵芝多糖的1640溶液基础上，进行抗原HbA1c两次脾内注射免疫；同时其在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0‑Ag14进行细胞融合，融合16小时后补充5×HAT溶液。本发明将传统免疫方法与两次脾内注射免疫相结合，同时联合口腔灌服7天黑灵芝多糖以提高阳性B淋巴细胞数量，有效缩短了单克隆抗体制备时间及抗原用量，采用杂交瘤融合16小时后补充5×HAT溶液，提高了融合率、阳性克隆率及HbA1c单克隆抗体获得效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速大量制备血红蛋白β链N末端缬氨酸糖基化(HbA1c)单克隆抗体的方法。

背景技术

血红蛋白β链N末端缬氨酸发生不可逆糖基化反应形成糖化血红蛋白(简称为HbA1c)，全血中糖基化血红蛋白占总血红蛋白(HbA1c+HbA0)的百分比反应机体1～3个月平均血糖水平，因此临床上常将HbA1c占全血总血红蛋白的比值作为糖尿病的诊断及临床治疗效果的观察指标。

HbA1c含量的检测目前主要包括两种：一种是基于糖基化与非糖基化血红蛋白所携带的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于糖基化与非糖基化血红蛋白的化学结构不同，如乳胶凝集免疫法、酶免法及亲和层析法，其中HPLC法和免疫学测定是目前糖尿病临床检测中常用的方法。

免疫学中HbA1c的检测采用的单克隆抗体，要求与HbA0不反应，与HbA1C及天然HbA1C反应。在HbA1c制备过程中，决定其功能的为血红蛋白β链N末端缬氨酸糖基化6肽序列VHLTPE。此6肽分子量不足2KD，因分子量小，进行常规免疫很难获得阳性B淋巴细胞，多次免疫血清效价较低，导致单克隆抗体制备周期延长^[1][2]。

实施脾内注射可以有效解决抗原分子量小影响免疫效果问题^[3]，同时在脾内注射前实施佐剂诱导机体增加T淋巴细胞MHCⅡ数量可以显著提高阳性B淋巴细胞数量^[4]，提高了HbA1c单克隆抗体制备的有效率。

参考文献

1.Parked D C,T cell dependent B cell Activation,Ann Rev Immunol,1993.

2.项岳辉，卢玲玲，图斐佩，等.糖化血红蛋白的单克隆抗体制备及鉴定，中国现代医生，2015.

3.梁骥，脾内免疫快速制备单克隆抗体及化疗药联合肿瘤疫苗治疗结肠癌，2013.

4.余强，黑灵芝多糖的免疫调节活性及其作用机制，2014.

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体方法。本发明方法能有效缩短抗体制备时间，提高阳性单克隆抗体的制备率。本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法，其在连续灌服7天含160μg/ml黑灵芝多糖的1640溶液基础上，进行抗原HbA1c两次脾内注射免疫；同时其在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合，融合16小时后补充5×HAT溶液。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明将传统免疫方法与两次脾内注射免疫相结合，同时联合口腔灌服7天黑灵芝多糖以提高阳性B淋巴细胞数量，可以在提高辅助T淋巴细胞数量条件下，增加MHCⅡ数量，提高配对的阳性B淋巴细胞数量，从而快速大量制备单克隆抗体，有效缩短了单克隆抗体制备时间及抗原用量，实现单克隆抗体工业化生产的需求。采用杂交瘤融合16小时后补充5×HAT溶液，提高了融合率、阳性克隆率及HbA1c单克隆抗体获得效率。