[发明专利]一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法

权利要求书

1.一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、前期准备

1、将医疗器械高压灭菌后，置于装有75％酒精的离心管中20min，放于培养皿中自然风干；

2、工作台放纱布；

3、将内皮细胞培养基置于37℃水浴；

步骤2、包被

将配好的包被液分别加入培养皿中，37℃孵育至少1小时，种细胞前PBS清洗3次；包被比例为：0.5ml/12孔板、1ml/6孔板、1ml/每3cm计数孔、3ml/10cm皿；

步骤3、取瓣膜组织

无菌环境下剪取猪瓣膜组织，置入4℃预冷无菌肝素生理盐水中冲洗干净；

步骤4、消化

1、将10ml浓度0.1％的I型胶原酶溶液加入15ml的离心管中，37℃温度下摇床60min；

2、取上清，放入2ml血清中混匀；

3、上清混匀后过滤，以800rpm的转速4℃温度下离心5min，离心后用5ml缓冲液重悬,细胞悬液加入15ml离心管中；

4、将重悬细胞缓慢加入配好的密度梯度液中，以3000rpm的转速4℃温度下离心35min，离心后可见液面分两层，上层为内皮细胞层，中间层为间质细胞层，离心管底层为红细胞层；

5、吸取上层内皮细胞层，细胞筛过滤后，以800rpm的转速4℃温度下离心5min，重悬，计数，种板。

2.根据权利要求1所述的一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1的医疗器械包括2把眼科剪、2把精细眼科镊。

3.根据权利要求1所述的一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2的包被液为层黏连蛋白(Laminin)、多聚赖氨酸(Poly-D-Lysine)或者明胶(Gelatin)，三者任选一种作为包被液。

4.根据权利要求1所述的一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1的内皮细胞培养基为50mL内皮细胞培养基，包括：F12培养基44mL，FBS5mL，100x青-链霉素500μL，内皮细胞生长补充物1.5mg，肝素250U，抗坏血酸125μg，谷氨酰胺500μL，4℃下贮存。