[发明专利]一种GITR人源化动物模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种GITR人源化动物细胞的构建方法，其特征在于利用基因编辑技术，将人源TNFRSF18基因的编码区替换鼠源Tnfrsf18基因的编码区，保留小鼠的UTR序列，所述人源TNFRSF18基因序列如SEQ ID No.1所示，所述替换的鼠源Tnfrsf18基因的编码区序列如SEQID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选择鼠源Tnfrsf18基因的编码区两端作为打靶位点，设计包含人源TNFRSF18基因的编码区的同源DNA供体和鉴定方案；

(2)基于CRISPR/Cas9技术，在鼠源Tnfrsf18基因的编码区的5’端和3’端各设计一条sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体或各自的表达载体；

或者，制备Cas9、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体；

(3)将Cas9、步骤(2)制备得到的sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体注射入受精卵，敲除鼠源Tnfrsf18基因的编码区的同时将人源TNFRSF18基因的编码区插入到基因组。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于基于CRISPR/Cas9技术，设计同源DNA供体的序列如SEQ ID No:3或4所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于基于CRISPR/Cas9技术，设计sgRNA的序列如SEQ ID No:5和6所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述小鼠为BALB/c或C57BL/6小鼠。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述受精卵为同背景野生型小鼠受精卵。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述受精卵为非GITR的免疫检查点基因修饰人源化小鼠的受精卵。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述非GITR的免疫检查点基因选自CD137、PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、BTLA、LAG3、TIM3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa或VISTA。

9.一种GITR人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的GITR人源化动物受精卵移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代动物，经基因型鉴定正确的F0代动物性成熟后与同背景野生型动物配繁获得F1代，即为GITR人源化动物模型。

10.一种双靶点基因修饰GITR人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的GITR人源化动物受精卵移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代动物，经基因型鉴定正确的F0代动物性成熟后与野生型鼠或者非GITR靶点人源化鼠交配，获得GITR杂合人源化小鼠，和双靶点杂合人源化小鼠，以此小鼠为基础，将其兄妹互配获得GITR单靶点和GITR与其他靶点双纯合人源化小鼠。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于所述非GITR的免疫检查点基因选自CD137、PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、BTLA、LAG3、TIM3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa或VISTA。

12.根据权利要求9-11任一项所述构建方法制备得到的GITR人源化动物模型在免疫检查点激活或抑制药物活性筛选及评价中的应用。