[发明专利]一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法

权利要求书

1.一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：具体包括以下步骤方法,S1、R1601-hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。

2.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S1中，将pCAMBIA1300Ⅰ质粒用BamHI、SacI双酶切，回收pCAMBIA1300Ⅰ质粒大片段，将hEGF与pCAMBIA1300Ⅰ大片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取转化成功的大肠杆菌DH5α菌落接种于LB液体培养基中37℃培养后，提取质粒DNA，即为构建的hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，于-20℃保存备用。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601感受态细胞，利用pCAMBIA1300I-hEGF表达载体的潮霉素抗性和发根农杆菌R1601的卡那霉素抗性，通过潮霉素和卡那霉素的双重抗性筛选，得到含有pCAMBIA1300I-hEGF的侵染菌株，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，对转化成功的发根农杆菌R1601(命名为R1601-hEGF)。

3.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S2中，利用吸光度值(OD₆₀₀)为1.0-1.5的R1601-hEGF菌液侵染鲁花11号花生的幼嫩叶片(并用发根农杆菌R1601侵染作为对照)，25℃，16小时光照，8小时暗培养，进行毛状根的诱导；每隔24小时转移至含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基，根据R1601-hEGF生长情况，在含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基和固体MS培养基之间进行转换，直至没有R1601-hEGF生长，然后放置于固体MS培养基，约2周即可诱导出毛状根；将毛状根从花生叶上切下，置于MS固体培养基上继代培养，用于PCR鉴定转入hEGF的花生毛状根，将转hEGF花生毛状根提取总蛋白，SDS-PAGE验证hEGF的表达，选择6.5KDa附近条带清晰且蛋白条带浓的毛状根株系继代培养。

4.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S3中，将筛选的转hEGF花生毛状根，截取2厘米以上，置于100ml MS液体培养基中，25℃±1℃，150rpm培养4-10周。

5.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S4中，将培养的转hEGF花生毛状根，每2周取样分析毛状根中的hEGF表达水平，其中到第6周时hEGF表达水平进入平台期，用ELISA法测hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，MTT实验表明花生毛状根表达的hEGF具有生物学活性，能够促进人肝细胞活力，LC-MS-MS检测表明表达的hEGF氨基酸序列与天然的hEGF序列一致。