[发明专利]一种肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)将来自患者的新鲜肿瘤组织剪碎，加入IV型胶原酶消化液，水浴以消化肿瘤组织，随后用无血清培养液清洗，得到细胞沉淀；(2)用含有细胞因子IL‑2的培养液重悬步骤(1)所得细胞沉淀，将重悬后的细胞置于CO₂培养箱中培养14～22天，得到扩增后的T淋巴细胞；(3)将步骤(2)所得T淋巴细胞和辐射后的Feeder细胞混合，然后用含有CD3抗体和CD28抗体的培养液悬浮混合后的细胞于培养瓶中，置于CO₂培养箱中培养；(4)向步骤(3)所得培养瓶内加入细胞因子IL‑2培养，即得所述肿瘤抗原特异性T淋巴细胞。采用上述方法能便捷有效地从肿瘤组织中制备肿瘤抗原特异性T细胞。

技术领域

本发明涉及淋巴细胞制备技术领域，尤其是一种肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的制备方法。

背景技术

免疫治疗是当今肿瘤治疗的热点之一，通过激活或者人工改造病人自体免疫系统，达到抵御肿瘤的效果，目前免疫治疗已被广泛用于很多类型的晚期、难治或复发型癌症。细胞治疗是肿瘤免疫治疗的重要方向之一，其中基于T细胞回输的细胞疗法在这一领域中取得了突破性进展。与其它类型免疫疗法不同的是，T 细胞疗法强调人工加强或改造病人自体T细胞，使治疗有很强的目的性和可控性，但与此同时，这类疗法需要更为复杂的工序和技术门槛，也有很多进一步优化的空间以提高其安全性和有效性。

存在于肿瘤组织的T细胞包含了可识别个体化肿瘤抗原的抗原特异性T淋巴细胞，但是，由于恶性实体瘤存在抑制性的免疫微环境，是T细胞免疫治疗的难点。因此，能便捷有效地从肿瘤组织中制备肿瘤抗原特异性T细胞工艺是市场急需的。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能便捷有效地从肿瘤组织中制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)将来自患者的新鲜肿瘤组织剪碎，加入IV型胶原酶消化液，水浴以消化肿瘤组织，随后用无血清培养液清洗，得到细胞沉淀；

(2)用含有细胞因子IL-2的培养液重悬步骤(1)所得细胞沉淀，将重悬后的细胞置于CO₂培养箱中培养14～22天，得到扩增后的T淋巴细胞；

(3)将步骤(2)所得T淋巴细胞和辐射后的Feeder细胞混合，然后用含有CD3抗体和CD28抗体的培养液悬浮混合后的细胞于培养瓶中，置于CO₂培养箱中培养；

(4)向步骤(3)所得培养瓶内加入细胞因子IL-2，4天后补加培养液，培养期间扩成多瓶，即得所述肿瘤抗原特异性T淋巴细胞。优选地，步骤(2)和 (3)中CO₂培养箱中培养条件为37℃以及CO₂体积浓度为5％；优选地步骤(3) 中采用竖立培养。

优选地，所述步骤(1)中无血清培养液为RPMI1640，步骤(2)、(3)、(4) 中所用培养液为淋巴细胞专用培养液VIVO。

优选地，所述步骤(1)中，IV型胶原酶消化液为IV型胶原酶溶于无血清培养液，终浓度为0.1mg/ml。

优选地，所述步骤(2)中，重悬后的细胞接种于细胞培养平板，在CO₂培养箱培养过程中扩孔时，调整细胞数量在1×10⁶/孔。