[发明专利]一种基于茎环爪探针的双链DNA检测方法及生物传感器

说明书

本发明公开了一种基于茎环爪探针的双链DNA检测方法，属于生物检测技术领域。所述检测方法包括：根据目标单链DNA和互补单链DNA分别设计发夹探针H1、H2和茎环爪探针SLCP1、SLCP2，检测时往含有目标双链DNA的溶液中加入H1、SLCP1和SLCP2，混匀，升温至目标双链DNA变性解链，再降温至温度介于茎环爪探针的熔点温度与双链DNA的熔点温度之间，使得茎环爪探针与互补单链DNA杂交形成杂交复合物，再降温，目标单链DNA识别结合H1，然后往检测溶液中加入H2，引发链式杂交反应，最后根据检测信号变化测定目标双链DNA含量。本发明通过茎环爪探针促进目标单链的释放显著提高双链DNA的检测性能。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于茎环爪探针序列特异性双链DNA检测方法及其用于液体活检中双链DNA或双链RNA的精准分析检测。

背景技术

在生物医学检测领域，通过鉴定人体外周血液中细胞释放的游离DNA，可以监测癌症治疗与复发、判断耐药性和诊断微小残留病变等情况。在过去的几十年里，世界各地的研究人员已经开发出各种具有高特异性和灵敏性的DNA检测生物传感器，然而，大多数报道的DNA检测生物传感器被用于检测选定的单链DNA序列，由于在自然界中(如人体外周血液)，DNA基本以双链的形式存在，当前开发的大多数DNA检测传感器并不适用。

关于双链DNA检测的传感器仍较少报导，特别是能序列特异性检测双链DNA的生物传感器更加稀少。当前，为了构建序列特异性双链DNA检测传感器，有三种主要的检测策略：1.肽核酸与双链DNA形成特异性三螺旋复合物的能力使其成为构建序列特异性双链DNA生物传感器的理想探针。2.Dervan等合成的发夹结构聚酰胺荧光团偶联物能够序列特异性检测双链DNA短片段(一般为4个碱基对)。3.锌指蛋白，限制酶和转录因子可以序列特异性识别和检测双链DNA。

然而上述三个策略应用于液体活检样本中双链DNA检测时，仍面临极大挑战。第一，肽核酸与双链形成三螺旋复合物时，只能形成T-A-T和C-G-C，对双链的序列有特殊的要求，在生物体内满足的特定双链DNA较少。第二，Dervan等发展的方法能够序列特异性检测双链DNA的序列较少。第三，能序列特异性识别双链DNA的蛋白或酶的种类较少，能检测实际样本中的双链DNA数目较少。

Kelley小组创造性地提出了使用DNA爪探针，利用电化学生物传感器检测癌症患者血清样本的双链DNA。在目标双链DNA高温变性后退火过程中，DNA爪探针可以与互补单链DNA杂交从而释放目标单链DNA，目标单链DNA与电极界面的探针识别后输出电信号实现双链DNA序列特异性检测。

然而上述使用DNA爪探针的双链DNA检测方法中，血清样本中的双链DNA需要提取并通过PCR扩增。此外，上述提出的DNA爪探针方法需要权衡DNA爪探针与互补单链DNA探针杂交稳定性：由于DNA爪探针也可以与电极界面的识别探针互补，虽然将DNA爪探针分为两段序列后可以降低DNA爪探针与电极界面的识别探针杂交稳定性，但是DNA爪探针与互补单链DNA的杂交能力也会随之降低，从而被释放的目标单链DNA数量降低而最终影响双链DNA的检测性能；因此，提高DNA爪探针与互补单链DNA的杂交能力有利于目标单链DNA的释放，然而过量的DNA爪探针会严重干扰电极界面识别探针捕获目标单链DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于茎环爪探针的双链DNA检测方法，以解决当前双链DNA分析中存在的缺陷。利用两条茎环爪探针与互补单链DNA杂交释放目标单链DNA，目标单链DNA引发HCR反应放大输出荧光信号，实现序列特异性双链DNA的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于茎环爪探针的双链DNA检测方法，所述双链DNA包括目标单链DNA和互补单链DNA，所述方法包括以下步骤：