[发明专利]一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法

说明书

本发明公开了一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法，通过敲除OsNramp5基因可快速创制低镉水稻品系，在常规CRISPR/Cas9介导的基因敲除中，转化植株当代突变体的鉴定和后代去除标记纯合突变体基因型的筛选若采用常规的测序方法进行检测，耗时费力，成本较高。为了克服如上所述缺点，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9敲除OsNramp5基因的工作中，可以在转化植株当代快速检测是否发生突变，并在突变体分离后代快速鉴定纯合突变个体的高分辨率溶解曲线检测方法。本发明提供的方法具有通量大，速度快，成本低的优点。

技术领域

本发明属于水稻分子育种技术领域，涉及一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法。

背景技术

水稻是一种易于富集镉的农作物，而耕地酸化或污染导致土壤中活性镉含量增加，又加剧了水稻中镉的积累，致使稻米镉超标事件频发。过量摄入镉严重危害身体健康，在我国南方的一些地区，稻米镉超标已经成为引起社会广泛关注的食品安全问题。选择种植镉低积累水稻品种是目前低成本快速解决稻米镉污染问题的最佳办法。研究显示，水稻中OsNramp5基因功能失活突变可使得籽粒中镉含量大幅降低[Ishikawa S,Ishimaru Y,Igura M,et al.Ion-beam irradiation,gene identification,and marker-assistedbreeding in the development of low-cadmium rice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(47):19166-19171]，因此OsNramp5基因突变体具有重要应用价值。

基因的靶向突变可采用基因编辑技术进行，包含利用锌脂蛋白核酸酶(ZFN)、类转录因子效应蛋白核酸酶(TALEN)及CRISPR系统等[Gaj,T.,et al.ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.Trends Biotechnol,2013,31(7):397-405]，利用基因编辑技术产生的双链断裂诱导产生的突变一般是1-数个碱基的缺失或/和插入(InDel)突变，难以通过普通PCR结合普通电泳的方法进行检测，因此需要借助DNA测序的方法进行，特别在基因编辑植物后代中去标记纯合突变单株的鉴定工作中，若采用测序对突变进行检测十分耗时费力，且成本较高，因而需要更为省时省力且廉价的方法。

单核苷酸多肽(SNP)或InDel突变可通过高分辨率溶解曲线分析法进行检测。在OsNramp5基因进行靶向敲除的工作中，通过高分辨率溶解曲线检测方法对特定靶序列突变进行检测可以提高试验效率，降低成本。

发明内容

本发明针对靶向基因敲除后用测序方法进行靶位点突变检测耗时费力的缺点，提供了一种在对低镉性状重要控制基因OsNramp5进行基因编辑时，对特定基因编辑位点进行检测的高分辨率溶解曲线方法。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、生物技术和农业领域技术。除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

本发明公开了一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法，所述OsNramp5基因特定位点是指水稻基因组DNA序列与SEQ ID No.1所示序列相同或存在95％以上序列相似性的位点。

优选的是，所述OsNramp5基因特定位点突变是通过CRISPR/Cas9系统完成的。

上述任一方案优选的是，所述CRISPR/Cas9系统采用sgRNA引导序列(guidesequence)为SEQ ID No.2所示的序列。

上述任一方案优选的是，包含以下步骤：

(1)制备靶向基因敲除水稻植株DNA；