[发明专利]一种肝素钠的提取方法

说明书

一种肝素钠的提取方法，属于多糖领域。所述方法如下：猪小肠洗净，刮取肠粘膜并收集至超临界CO₂萃取装置反应釜中。向反应釜中加入质量5%的胰蛋白酶，搅拌使其充分混合。设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，反应1.5~2h。将混合物过滤，去除滤液，沉淀物用蒸馏水漂洗并去除滤液。将沉淀物薄涂在平皿中于冻干机中进行冻干，磨粉。将粉状的肠粘膜装入超临界CO₂萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取1.5~2h，去除多余的脂肪，即得肝素钠。本发明的优点是：通过超临界CO₂促进胰蛋白酶的酶促反应的发生，大大缩短了反应时间，超临界CO₂萃取法还具有一定的杀菌作用，较传统工艺要具有更好的提取效果。

技术领域

本发明属于多糖领域，具体涉及一种肝素钠的提取方法。

背景技术

肝素钠是一种粘多糖，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用，其后果涉及阻止血小板凝集和破坏、妨碍凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而发挥抗凝作用。肝素钠在提取过程中最关键的步骤便是胰蛋白酶的水解过程。

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme）为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏中提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。最近有研究表明，超临界流体对酶促反应的发生具有一定的促进作用。

超临界流体（supercritical fluid，SCF）是指温度及压力处于临界温度及临界压力以上的流体，是一种液气态处于均相中的流体。这种流体兼有液体和气体的优点，黏度小、扩散系数大、密度大，具有良好的溶解性和传质性，且在临界点附近流体对压力和温度的变化非常敏感，既是一种良好的分离介质，又是一种良好的反应介质。此外，由于SCF具有连续变化的物性，可以通过影响其局部作用来控制反应活性和选择性。作为一种非水反应介质，SCF以独特的性质在酶催化领域中受到越来越广泛的关注。所以将酶置于超临界状态下也可使其催化动力学得以改善。以超临界CO₂为例，在高压下CO₂ 改变了酶微环境中的pH值，共价修饰蛋白表面的自由氨基并形成氨基甲酸盐，这些氨基甲酸盐改变了赖氨酸残基的电荷，从而改变了酶的活性。

目前比较常用的肝素钠提取技术路线如下：新鲜猪小肠洗净→刮取肠粘膜→肠粘膜/浆膜/肠衣投入反应锅→加入质量5%的胰蛋白酶→3mol/L的NaOH溶液调pH值为8~9→搅拌升温至40℃左右→维持2.5h→再升温至60℃→加入质量2%的NaCl→升温至90℃→调pH值为6~7→加热至沸腾保持10min→趁热过滤→冷却至60℃左右，用3mol/L的NaOH溶液调pH值为8~9→按滤液量的5％加入D-254树脂→搅拌吸附6h，静置1h，过筛→树脂中加入等体积自来水漂洗数次→用pH值为10的3mol/L的NaOH溶液搅拌洗脱树脂2h，过筛，收集滤液→重复洗脱2次，合并滤液→在滤液中加入等体积乙醇，搅拌10min，静置12h以上→收集下层沉淀物，用乙醇脱水3次→将沉淀物置60℃烘箱中烘干，得粘多糖。这种工艺操作比较复杂，消耗时间较长，提取过程中也多有损耗。

发明内容