[发明专利]小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法

说明书

本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1‑CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。本发明还提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。本发明分离并培养获得的循环肿瘤细胞质量均一，经过免疫荧光、增殖、侵袭迁移及致瘤能力实验鉴定符合循环肿瘤细胞的特性，是实验室研究肿瘤转移较好的实验对象，也为临床预测乳腺癌转移、检测化疗药物敏感性提供了良好的研究模型。本发明的循环肿瘤细胞分离及培养方法简单，成本低，易于操作，分离的细胞可传代，为实验室研究循环肿瘤细胞特性、肿瘤转移机制提供了很好的研究工具。本发明在肿瘤转移研究方面将会有广泛的应用。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。

背景技术

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，并且是女性肿瘤相关死亡的主要原因，据2015年统计，在中国有大约27万乳腺癌新增病例，大约7万患者死亡，肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，而循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移过程中起到了关键作用。国内外大量研究证实乳腺癌患者血液中循环肿瘤细胞与患者临床分期、预后及肿瘤转移复发密切相关。2018年美国AJCC指南中将循环肿瘤细胞列为乳腺癌预后评估的一项生物学指标。故循环肿瘤细胞的早期捕获对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都具有重要的指导作用。

循环肿瘤细胞的检测有创伤小易重复的优点，故循环肿瘤细胞的捕获、分离及培养技术是关键环节。目前为止，尚未见到小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系建立的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。

本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。

本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

(1)取乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的外周血至枸橼酸钠抗凝剂中，得到抗凝血，将抗凝血轻轻移至含有小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心，吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗后离心，获得细胞沉淀；

(2)将步骤(1)得到的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；培养24h-48h后，更换培养液，之后每48h更换一次培养液，通过更换培养液将悬浮的白细胞清除，得到贴壁生长的细胞，即为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞。

作为优选，步骤(1)中，所述乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步骤：用无菌PBS重悬处于对数生长期的乳腺癌细胞系4T1单细胞，接种至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪垫，饲养35天到40天，至小鼠模型出现消瘦、衰竭状态。

作为优选，步骤(1)中，所述小鼠模型为SPF级BALB/c小鼠。

作为优选，步骤(2)中，所述DMEM1640培养基中还加入1％青链霉素。

作为优选，步骤(2)中，待贴壁生长的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系细胞密度达到70-80％时开始传代培养。

作为优选，所述传代培养的具体方法为：弃掉培养液，用无菌PBS液漂洗后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室温消化，当细胞变圆后，加入含有10％FBS的DMEM1640培养液将细胞吹散制备为单细胞悬液，然后将细胞悬液移至培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。

作为优选，所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的冻存方法为：将处于对数生长期的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室温消化为单细胞，离心获得细胞沉淀，缓慢加入细胞冻存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，次日在液氮中保存。