[发明专利]一种提高L-赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌构建方法

说明书

本发明涉及一种提高L‑赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌的构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的Tnp7a基因失活后构建获得，Tnp7a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种提高L‑赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，构建的该菌株由于内源基因Tnp7a失活降低了谷氨酸棒状杆菌在保存和发酵过程中的因环境改变而激活插入序列的转座效应，阻断基因组由于转座产生的突变或移码，或者通过其携带的启动子调节相邻基因的表达而引起的菌种退化进程，提高L‑赖氨酸产量。

技术领域

本发明涉及一种提高L-赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，属于生物工程领域。

背景技术

L-赖氨酸为白色或近白色自由流动的结晶性粉末，是蛋白质的重要组分之一，也是人和动物体不能自身合成但又十分需要的八种氨基酸之一，因食物中经常缺乏，所以又被称为“第一必需氨基酸”。L-赖氨酸具有多种生理功能，如具备平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料添加剂、食品强化剂和制药等领域。由于市场需求旺盛，L-赖氨酸目前已成为仅次于谷氨酸的第二大氨基酸品种，年产量约350万吨。工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种，即蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于具有低成本、高产率、低污染等优势成为目前L-赖氨酸生产的主流方法。

目前可用于L-赖氨酸生产的微生物主要为细菌，包括棒状杆菌、短杆菌、念球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，其中以属于棒状杆菌属的谷氨酸棒状杆菌目前应用最为广泛。虽然自然界微生物能够直接发酵产生L-赖氨酸，但产量通常较低，因此需要对微生物进行改造。如中国发明专利CN1539015公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796(申请号200780048626.8)、CN1974760(申请号200610163142.5)、CN103243042(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。虽然目前已有多种提高L-赖氨酸产量的报告，但L-赖氨酸仍有进一步提高的必要性，此外，现有L-赖氨酸生产菌种在保存和发酵过程中多有菌种退化现象，因而仍需改进。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种提高L-赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌的构建方法。本发明通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌内源基因Tnp7a(编码一种ISL3转座酶蛋白，受不良环境等因素诱导)以降低谷氨酸棒状杆菌在保存和发酵过程中的因环境改变而激活插入序列的转座效应，阻断基因组由于转座产生的突变或移码以及通过其携带的启动子调节相邻基因的表达而引起的菌种退化进程，进而提高L-赖氨酸产量。

术语说明

本发明中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因Tnp7a的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。

本发明中，“失活”可以通过基因工程手段在基因Tnp7a中插入一个或多个碱基对，或者缺失该基因Tnp7a中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。

本发明技术方案如下：

提高L-赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的Tnp7a基因失活后构建获得，Tnp7a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。