[发明专利]一种突变蛋白的方法以及得到的突变体蛋白

说明书

本发明提供一种改变蛋白与其结合伴侣的结合能力的方法以及通过这种方法获得的突变体蛋白。所述方法包括以下步骤：1)在所述蛋白中增加糖基化位点；和2)获得在所述增加的糖基化位点包含糖基化修饰的突变体蛋白。本发明的方法获得的突变体蛋白在降低与其结合伴侣的结合能力的同时，仍能具备所需的生物学活性。本发明的方法获得的突变体蛋白与天然蛋白在结构上接近，从而具备极低的免疫原性。本发明方法操作简便、易于扩大并且便于质量控制。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域。具体地说，本发明涉及新颖的蛋白定点突变方法以及获得的突变体蛋白，所述突变体蛋白相比于原始蛋白与结合伴侣的结合能力改变。

背景技术

定点突变技术是在已知DNA系列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变酶的结构中的个别氨基酸残基。定点突变有的是改变特定的核苷酸，有的则是对一段最可能影响酶的功能与性质的基因序列进行随机突变，从而产生一系列突变酶分子。定点突变技术有多种方法，如寡核苷酸引物介导的重组PCR定点突变法，限制性内切核酸酶酶切片段取代法，盒式突变法和化学全合成法等。定点突变是在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或模块，从而产生新性状的酶，故又称理性分子设计。

自从人类第一次采用定点突变技术对已知结构和机理的一种酶活性位点进行改造以来,蛋白质工程(Protein Engineering)已经历了20年多的发展历程。现在该技术已能够对蛋白质的活力、特异性、稳定性和折叠性进行预期的设计改造。工程化的蛋白质已成功的应用于制药工业和许多重大疾病的治疗。蛋白质工程药物分子设计是第三代蛋白质工程药物的特征,研究蛋白质结构-功能-活性间的相互关系，设计蛋白质空间结构，并以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建,随后可通过高通量筛选技术的应用及加工工艺的发展等策略来获得有新药开发价值的生物分子。在这基础上进行设计新型蛋白质、多肽或其它代谢分子，包括疫苗、酶、抗体、治疗肽及其它一些生物分子，并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。运用这些方法基本上均可对所有的蛋白质序列和结构的修饰达到预期的功能目的。

本领域熟知，蛋白质在体内具备的功能往往是非常复杂的。因此，在实际应用中，更希望对某一蛋白的各功能进行不同方向的调整。即，有的功能或活性希望下调，但有的功能或活性需要保持、甚至上调。

此外，目前的定点突变方法会增加免疫原性或对蛋白结构功能产生不利的影响。例如，IL-2在免疫应答中具有双重功能，这在于它不仅介导效应细胞的扩充和活性，而且还至关重要地涉及维持外周免疫耐受。因此，接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经学、皮肤、血液和系统性不利事件。大多数的这些副作用可由所谓的血管(或毛细管)渗漏综合征(VLS)的形成解释。已在患者中测试低剂量IL-2方案以避免VLS，然而，这是以降低治疗结果为代价的。

目前已经采用数种办法来克服与IL-2免疫治疗相关的问题。例如，通过突变IL-2来降低其毒性和/或提高其功效。然而，已知的IL-2突变体无一显示克服上文提及的与IL-2免疫治疗相关的问题，包括由诱导VLS导致的毒性，由诱导AICD导致的肿瘤耐受性和由激活Timf细胞导致的免疫抑制。例如，罗切格利卡特公司(CN103492411A)突变了IL-2中F42A、Y45A、L72G三个位点的氨基酸，降低了IL-2蛋白对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留所述突变体IL-2蛋白对中等亲和力IL-2受体的亲和力，但同时也降低了IL-2的生物学活性。此外，大规模的氨基酸残基替换也很容易增强所得蛋白突变体的免疫原性。

因此，本领域急需新的方法来改变蛋白与其结合伴侣的结合能力，但仍能维持该蛋白的所需生物学活性，并且不显著增强所得蛋白突变体的免疫原性。

发明内容