[发明专利]一种敲除ZmPAD1基因提升高直链玉米产量的实验方法

说明书

本发明公开了一种敲除ZmPAD1基因提升高直链玉米产量的实验方法，属于基因工程领域，主要包括：构建ZmPAD1基因敲除CRISPR/Cas9载体，获得ZmPAD1基因敲除的高直链淀粉玉米植株。该方法利用ZmPAD1蛋白对玉米淀粉分支酶SBEIIb的相互作用，通过调节ZmPAD1对主基因ZmSBEII参与的淀粉合成过程的修饰作用提升玉米籽粒平均重量。该基因工程方法的实现对利用淀粉合成修饰基因提升特种玉米的产量具有重要的实践意义。

技术领域

本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种敲除ZmPAD1基因提升高直链玉米产量的实验方法。

背景技术

高直链淀粉玉米中所含的直链淀粉具有独特的物理和化学性质，被广泛应用于食品、医疗、纺织、造纸、包装、石油、环保、光纤、高精度印刷线路板和电子芯片等30 多个领域。高直链玉米淀粉作为抗性淀粉（抗酶解淀粉）在人体内缓慢释放葡萄糖，具有较低的胰岛素反应，可控制糖尿病患者血糖平衡，并在肠道内束缚脂类，减少人体脂类吸收，且能减少结肠癌的危险。在美国，玉米原淀粉售价20美分/磅左右，而高直链玉米淀粉价格可提高至2.5美元/磅，可见后者经济效益可观。80 年代初，美国卡斯汤姆种子公司（Custom FarmSeed）利用ae（ZmSBEIIb）及其修饰基因，采用轮回选择法培育出7 级（含直链淀粉70％-80％）高直链淀粉玉米杂交种, 进一步经过10年以上的轮回选择法积累并选择修饰基因，获得了直链淀粉含量超过85%的高直链淀粉玉米品种。然而与普通马齿玉米不同，高直链淀粉玉米种子的发芽率较低，拱土能力较差，株型发育不佳，由非直链淀粉玉米花粉产生的花粉直感作用也会降低高直链淀粉玉米的品质，其产量不仅极不稳定，且较马齿玉米和糯玉米杂交种减产20%以上，即使在美国，高直链淀粉玉米的种植面积也未超过2万公顷，而且大多是签约种植。因此，高直链淀粉玉米产量向上的研究受到广泛的重视，并已成为当今国内外玉米生产科学的一个最新研究热点和亟待解决的问题。

目前，玉米高直链淀粉的形成主要以ae基因的突变为基础，且以高直链淀粉代谢修饰基因的调整为前提。近年来蛋白相互作用研究技术的发展不仅有利于快速寻找参与调控与植物遗传表型相关的修饰基因，并且可在细胞和蛋白分子水平上深化植物生长与发育机理的研究。研究淀粉代谢修饰基因对胚乳淀粉合成的调控机制是探明高直链淀粉玉米产量低下的有效途径之一。玉米胚乳中影响淀粉分支的ZmSBEIIb基因受反义RNA抑制后，其直链淀粉含量大幅提高（国际专利W094/04693A2），但是与ZmSBEIIb主基因“表现度”相关的修饰基因在淀粉代谢的调控分子机理研究尚属空白，这可能也是高直链淀粉玉米产量在实践上无法向上突破的理论瓶颈。本项研究在利用一系列的候选实验技术鉴定出ZmPAD1是SBEIIb的有效互作调控因子的基础上，利用CRISPR/Cas9系统敲除高直链淀粉玉米的ZmPAD1基因，可以有效提升玉米籽粒平均重量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供了一种敲除ZmPAD1基因提升高直链玉米产量的实验方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种敲除ZmPAD1基因提升高直链玉米产量的实验方法，包括：

构建ZmPAD1基因敲除CRISPR/Cas9载体，获得ZmPAD1基因敲除的高直链淀粉玉米植株；所述的ZmPAD1基因敲除的高直链淀粉玉米植株的玉米籽粒平均重量高于非转化植株；所述的ZmPAD1基因敲除CRISPR/Cas9载体中的sgRNA 对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其中sgRNA启动子为OsU3，Cas9蛋白的启动子为加强型玉米Ubi启动子，卡那霉素抗性基因的启动子为CaMV 35S。

进一步地，采用基因编辑的方法将目的特种玉米中的ZmPAD1基因敲除，包括以下步骤：

根据ZmPAD1基因序列确定 sgRNA 靶向序列（SEQ ID NO.1）；

以sgRNA 靶向序列的多聚寡核苷酸为基础，在正义链的5'加A，反义链的5'加T；