[发明专利]一种固液结合制备利拉鲁肽的方法

说明书

本发明涉及多肽合成领域，本发明采用固相化学的方法制备利拉鲁肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Ala‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Pal)‑OtBu)‑OH参与固相合成利拉鲁肽,通过引入此单体参与利拉鲁肽的固相合成，提高了粗肽纯度，降低了纯化难度，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固相和液相结合制备利拉鲁肽的方法。

技术背景

糖尿病是一种常见的慢性疾病，其症状包括尿液分泌过多、常有饥饿感、体重减轻、视力减退等。持续性血糖浓度升高还容易引发心脏、血管、眼睛、肾脏和神经等多种组织器官病变，影响人的身体健康。2017年全球有4.25亿糖尿病患者，在所有国家中，中国糖尿病负担最重，患者人数(1.14亿)占全球近27％。预计2045年，全球糖尿病患者将进一步加重，人数可达7亿。

利拉鲁肽(Liraglutide)，商品名Victoza，由丹麦诺和诺德公司研发，于2010年1月25日在美国上市，2011年3月4日获SFDA批准，进入中国市场。用于成人2型糖尿病患者控制血糖，适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。

利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。

利拉鲁肽化学表述为Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基))]-GLP-1^7-37，分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，相对分子质量为3751.2，CAS号为204656-20-2，序列信息如下：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu(N-α-Pal)–OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；

目前，诺和诺德公司主要通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg³⁴-GLP-1^7-37，还需要和N-α-十六酰基-Glu(OSu)-OtBu反应，利用化学方法在Lys²⁶接上侧链；由于Arg³⁴-GLP-1^7-37的侧链均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。

还有报道采用固相化学法制备利拉鲁肽，主要集中在侧链修饰的连接策略上：如专利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH参与接肽反应，Pd(PPh)₃脱Alloc，然后连接侧链；CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH参与接肽反应，用1％TFA/5％TIS/DCM脱侧链保护剂，连接侧链；CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-OH参与接肽反应，水合肼脱侧链保护基，然后接侧链反应；CN103980358A采用先液相合成单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)-OtBu)-OH,然后参与接肽反应。

本发明人用现有的合成方法，制备利拉鲁肽，发现纯度和收率均不高，不适于工业规模生产。为此，本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。