[发明专利]中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法

说明书

本发明公开了一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，涉及中药材生物活性检测技术领域，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验，在中医药中，藏青果和诃子是两种不同的中药，二者均来源于使君子科植物诃子，藏青果是未成熟果实，诃子是成熟果实，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性，诃子酸和诃黎勒酸能够通过抑制病毒神经氨酸酶介导的后代病毒粒子的释放从而抑制甲型流感病毒的释放，且药效效力几乎不受替代作用的影响，是对抗流感病毒的很好的抗病毒候选者，从而对中药中的抗病毒药物品类进行了补充，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。

技术领域

本发明涉及中药材生物活性检测技术领域，具体为一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法。

背景技术

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类患流行性感冒的RNA 病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。此外在人类出现的各种流感中，易感人群都是儿童，所以更需要儿童流感的防治。

中药抗流感具有很多优势，一是在抗病毒同时，许多药物兼有解热、抗炎等作用，对病毒引起的感染具有多重作用，如缩短发热的时间、控制炎症的扩散、促进炎症的吸收等，即多途径、多方位起作用；二是在抗病毒同时，部分药物还能增强机体免疫功能，阻止病毒进入细胞组织；三是在抗病毒同时，一般很少伤害正常组织细胞，毒副作用较小；四是由于中药采取的是个体化的治疗，对病情更具有针对性。正是由于这种治疗过程中中药有效成分的多元化，病毒难以对其产生抗药性，使得中药在治疗病毒感染性疾病方面具有明显的优势，临床使用前景广阔。

本专利意在从中药中筛选新的潜在的抗病毒药物，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性。

(二)技术方案

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验。

所述高通量筛选过程为：用带有报告基因的重组流感PR8-PB2-Gluc对352 种中药水提物进行高通量筛选，白色96孔板每孔铺104个细胞，24小时后，用重组流感病毒PR8-PB2-Gluc以moi＝0.01感染细胞，同时用中药进行干预，设置健康对照组和流感阴性对照组，孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，筛选出抑制率90％的中药，筛选出的单体从100uM开始，3倍稀释，做8个稀释度，利用GraphPadPrism软件，通过拟合剂量依赖性曲线得出单体的IC50和CC50；

所述病毒释放抑制实验过程为：为了确定中药和其已知成分是否可以抑制后代病毒粒子的释放，PR8-PB2-Gluc病毒以MOI＝0.1感染MDCK细胞，12 小时后，吸弃掉原有培养液，PBS洗3遍，换为新鲜的含有不同浓度药物和 2ug/mLTPCK-trypsin的Opti-MEM，孵育2小时后，收集上清液，并检测上清液中的荧光素酶活性；

所述神经氨酸酶抑制实验过程为：在不同浓度的待测中药或单体的存在下，将神经氨酸酶和神经氨酸酶底物孵育，1小时后，检测荧光信号的强度，激发波长为322nm，发射波长为450nm，荧光信号的下降程度即表示神经氨酸酶抑制效果；

所述病毒滴度降低实验过程为：将MDCK细胞铺于24孔板中，用耐达菲株甲型流感病毒/H1N1pdm(09)以MOI＝0.01感染，用不同浓度的待测药物进行干预，36小时后，收集上清液，用MDCK细胞检测上清液中的病毒滴度 (TCID50/mL)。