[发明专利]一种胚胎玻璃化冷冻液

说明书

本发明公开了一种胚胎玻璃化冷冻液，本发明的胚胎玻璃化冷冻液，通过冷冻液中添加羟丙基纤维素(HPC)与人血白蛋白(HSA)及甘油的三种试剂联合作用，起到更好的抗破坏的能力。胚胎用玻璃化冷冻液处理冻存后，可提高胚胎解冻后体外胚胎的囊胚形成率。本发明的玻璃化冷冻液可以大幅度提高成胚胎冷冻解冻后囊胚形成率。

技术领域

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种胚胎玻璃化冷冻液。

背景技术

胚胎的冷冻保存技术是指采用慢速或快速的降温方法，将胚胎低温冷冻，然后超低温保存在液氮中。

胚胎玻璃化冷冻基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生玻璃化时能起到保护作用。所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。有别於慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶，进而造成胚胎的伤害，玻璃化冷冻技术的特色就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻之缺点。换言之，胚胎的冷冻保存与解冻的成败与否，不单是胚胎品质的好坏，同时必须靠冷冻保存中有无一个完全无结冰生成的冷冻过程。而玻璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡后，细胞体积可因脱水而减少30-50％，然后将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。

低温使膜通透性的丧失与脂质成分的改变，膜脂的相变破坏了膜蛋白的功能，膜蛋白负责离子运输和代谢，水通道蛋白受到影响，细胞质Ca²⁺水平的增加导致容性改变，离子泄漏。细胞内钠的浓度由依赖于钠钾的ATP酶调节，ATP酶对低温非常敏感。在低温下，其活性的降低会损害钠泵的正常功能，导致从细胞外环境中吸收钠离子，钠离子堆积导致细胞内蛋白质变性，对细胞核和DNA是有害，阻碍了胚胎低温保存。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种胚胎玻璃化冷冻液。细胞内钠的浓度依赖于钠钾的ATP酶调节，ATP酶对低温非常敏感。在低温下，其活性的降低会损害钠泵的正常功能，导致从细胞外环境中吸收钠离子。本发明冷冻液能增加质膜流动性，减少低温对钠泵正常功能的影响，减少钠离子过多对胚胎的伤害，抵抗大量水分快速进入细胞导致渗透性休克。

为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种胚胎玻璃化冷冻液，包含冷冻液一和冷冻液二：

所述胚胎玻璃化冷冻液中含有羟丙基纤维素并且是针对所有的胚胎玻璃化冷冻液都是适用的。

所述冷冻液一的组分为全程胚胎培养液、5-8％乙二醇、5-8％DMSO、0.4-0.8mol/L海藻糖、0.1-0.5mol/L羟丙基纤维素、0.4-0.5％HSA、0.5-0.6％甘油，组分中的百分含量指的是各组分占冷冻液一的体积百分数，DMSO为二甲基亚砜，HSA为人血白蛋白；

所述冷冻液二的组成为全程胚胎培养液、12-15％乙二醇、12-15％DMSO、0.4-0.8mol/L海藻糖、0.1-0.5mol/L羟丙基纤维素、0.4-0.5％HSA、0.5-0.6％甘油，组分中的百分含量指的是各组分占冷冻液二的体积百分数。