[发明专利]一种组织工程化神经组织及其构建方法

说明书

本发明公开了属于组织工程技术领域的一种组织工程化神经组织及其构建方法。本发明使用蚕丝丝素蛋白和胶原复合材料，以原代皮层神经元为种子细胞进行三维培养，形成一种组织工程化的神经组织。其操作步骤简单，容易重复，没有特殊的工艺或设备要求。该体系下构建的神经组织产生具有丰富网络连接的神经网络。本发明使用到的丝素蛋白其机械性能适合于神经细胞接种及培养，其弹性模量与大鼠脑组织相接近。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程化神经组织及其构建方法。

背景技术

人脑是神经系统最高级部分，是中枢神经中最大和最复杂的结构，是调节机体功能的器官，也是意识、精神、语言、学习与记忆等高级神经活动的物质基础。人脑结构复杂，有着丰富的沟回褶皱、复杂的神经网络及突触联结型式。为了洞悉脑的基本单元，例如神经网络的形成和活动规律，可以使用体外的脑研究模型，来概括天然脑组织结构和功能的复杂性。体外脑模型旨在重建脑组分的基本结构并在可控的实验条件下进行脑的细胞生物学研究。

中枢神经系统(CNS)可能受到各种疾病的影响，如血管，结构，功能，传染性或退行性疾病。每年有680万人因神经系统疾病而死亡，只有少数疾病有可用的治疗方法。许多CNS靶向疗法在临床试验期间失败，部分原因是由于使用了不充分的临床前研究模型，这些模型不允许通过生理相关功能读数评估急性和慢性影响，进一步推动了人们对于体外脑模型的需要。利用组织工程策略能够构建出良好的体外组织工程化神经组织以满足临床需要。

目前对神经网络的生物学和信号处理的了解主要源自二维培养的原代脑来源的细胞。二维培养相对简单，是传统的分析方法，现在广泛认为基于组织工程策略体外三维培养构建的组织相比传统的二维培养更加能够反应体外真实微环境。近年来，诸多三维组织模型已经用于重塑脑疾病表型例如阿尔茨海默病或头小畸形症，表明这些三维组织模型可用作为研究发育生物学模型、神经电生理模型、药物筛选与评价模型。

已有关于三维组织的专利，如公开号为CN2013446628A、CN103877623A的专利，但几乎全是外周神经组织工程构建的产品，而中枢神经组织构建及其相应的方法未见专利申请。公开号为CN102228718A的专利公开了一种组织工程化神经组织及其构建方法，该技术方案使用到的胶原/Matrigel胶为水凝胶类生物材料，其质地较弱，力学性能相较神经细胞来说不适合，而且也容易降解。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种组织工程化神经组织及其构建方法。

为达到上述目的，采用如下技术方案：

一种组织工程化神经组织及其构建方法，按照如下步骤进行：

(1)制备浓度为6-12％的丝素蛋白溶液；

(2)制备多孔支架，用直径6mm的punch打孔，裁剪支架材料厚度在2-3mm，接种前进行高压灭菌；

(3)分离培养MEF细胞并进行脱细胞处理；

(4)分离神经元；

(5)细胞接种：细胞接种前，使用培养基浸泡细胞衍生的细胞外基质修饰的支架材料1小时，吸除细胞培养基；使用细胞种植液对细胞进行重悬，接种前吸干支架材料上多余的水分，使用10ul的细胞悬液在材料上进行接种，使每个支架材料上接种2x10⁶cells/scaffold/10μl，然后置于孵箱内过夜，8小时后沿着孔板管壁添加细胞维持液；

(6)长期培养：将构建的样品从96孔板转移到24孔板中，并添加细胞维持液，确保构建体完全浸没于培养液中以获取充分的营养交换，接下来的培养需要隔天半量换液。