[发明专利]一种膜结合型mFLT3LG蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种膜结合型mFLT3LG蛋白及其应用，通过对FLT3LG的蛋白序列重新进行原创性设计，清除其酶切位点并确保锚定在膜表面，得到全新的嵌合的膜结合型mFLT3LG(membrane FLT3LG)的蛋白序列，将全新的膜结合型mFLT3LG的ORF克隆到载体上，并且与VSVG放置于同一个表达质粒上，用双启动子启动，显著提高慢病毒对HSC的感染效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种膜结合型mFLT3LG蛋白及其应用。

背景技术

基因治疗(Gene Therapy)是指将外源DNA片段导入靶细胞，以纠正、修复、替换、补偿或沉默等方式对缺陷和异常基因进行针对性干预，以期恢复健康的遗传信息，最终达到治疗甚至临床治愈的目的。如何将外源DNA片段高效、安全地导入靶细胞细胞核内部是基因操作的核心问题。

不管是在体内还是体外条件下，病毒介导的DNA片段呈递是基因操作的关键技术。当前已有多种天然病毒被借鉴开发成病毒呈递系统，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等，这些病毒系统在生命科学以及临床医学研究领域得到了广泛应用，为当今的科学研究发展起到了至关重要的推动作用。

基于HIV病毒而开发的慢病毒系统因其显著优点，成为目前最广泛应用的基因操作技术。慢病毒系统不仅可以感染分裂期细胞，还可以感染静止期细胞，这为在神经细胞或心肌细胞中进行基因操作提供了绝佳的途径；慢病毒系统有效载荷最高可以达到5kb，这为大片段DNA的呈递提供了可能；此外，慢病毒的整合后长期稳定表达特性，基于VSVG包膜蛋白的泛嗜性感染能力，均赋予慢病毒系统强大的基因扰动能力以及广泛的兼容性。正因此，慢病毒系统已经成为生命医学领域中基因操作的主要技术手段。基于慢病毒系统对缺陷基因进行修复或者补偿甚至引入全新基因已经成为基因治疗的一个重点研究方向。如免疫治疗领域的CAR-T细胞就是通过慢病毒包装抗体基因感染T细胞，孵育T细胞全新的抗原识别能力，专项识别肿瘤细胞继而达到杀伤作用。

慢病毒系统在演变上主要分三个代次，当前广泛应用并最有可能在临床研究中按照GMP级别生产的是第三代系统。第三代慢病毒系统主要由外源基因表达质粒、HIV病毒复制组装必需的结构蛋白gag-pol表达质粒、病毒基因组RNA出核运输蛋白Rev表达质粒、包膜蛋白VSVG表达质粒等四个载体组成。其中，包膜蛋白VSVG来自水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus)，该包膜蛋白包裹的RNA病毒可以感染鼠、马、牛、猪以及灵长类等多种动物细胞，因此具有泛嗜性的侵染能力，在目前生命医学研究领域广泛应用，已经成为最主要的慢病毒包装用的包膜蛋白。第三代慢病毒整体比较稳定，但在某些重要领域依然亟需进一步改进，仍有很大的优化和提升空间。慢病毒在感染贴壁细胞如293T细胞中体现出强大的转导效率，MOI值为1即可有效感染293T细胞。但是对悬浮的血细胞感染一直表现弱势，尤其对于造血干细胞的感染，MOI值甚至需要达到100才能实现有效感染。而造血干细胞却往往是基因治疗的终极靶向细胞，相当多的血液疾病只有在造血干细胞中进行基因操作才能够有长期稳定治疗的效果。

但是VSVG包膜蛋白也存在明显弊端，如VSVG蛋白的细胞膜受体还不太明确，有文献报道是细胞膜表面的神经酰胺分子，也有文献发现LDL receptor是VSVG的结合蛋白。由于不同类型的细胞表面表达的VSVG受体丰度不一，造成有些细胞很容易被VSVG包被的慢病毒感染，如293T细胞、HT1080细胞等；而很多血液细胞表面的LDL receptor表达丰度很低，如T细胞、B细胞、HSC(Hematopoietic stem cell，造血干细胞)等，导致他们很难被VSVG包被的慢病毒感染，这就为血液细胞尤其是HSC进行慢病毒感染的基因治疗带来了技术难度。临床应用级别的HSC往往需要100million数量级的细胞实现基因操作，而较低的感染效率则对慢病毒的产量和质量提出了非常高的要求，显著增加了试验成本，事倍功半。