[发明专利]Escherichia coli M4突变株及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，提供了Escherichia coli M4突变株及其制备方法和应用。将铜绿假单胞菌折叠酶基因进行易错PCR，然后将突变的折叠酶基因和铜绿假单胞菌脂肪酶基因克隆到pACYCDuet‑1重组质粒，转入E.coli BL21(DE3)进行共表达，经过初筛和复筛后，得到的一个突变株，其胞内脂肪酶的比活力是未突变株的2.1倍。与未突变株相比，突变株中重组折叠酶的一个氨基酸残基发生了变化，由甘氨酸突变为谷氨酸。该发明为提高脂肪酶活性提供了新方法。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及Escherichia coli M4(简写为E.coli M4)突变株及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪酶不仅在工业、农业和畜牧业等传统产业中受到广泛的应用，在生物传感器、生物柴油合成、诊断工具酶等领域也越来越受到重视。脂肪酶来源非常广泛，它可以通过培养微生物提取，也可以从动植物体内获得。微生物性脂肪酶具有催化活性多样性、产量高、便于提取和微生物生长周期短、基因操作较容易等特点，因此相对于动物和植物来源的脂肪酶，微生物性脂肪酶运用更加广泛。来自铜绿假单胞菌的脂肪酶是研究历史较长的脂肪酶。它具有较高的活性、稳定性和选择性。但是铜绿假单胞菌中的脂肪酶依赖于特异性折叠酶，需在折叠酶的帮助下才能正确折叠为具有活性的构象。

脂肪酶和其特异性折叠酶具有较高的亲和力。研究证明它们之间主要是通过疏水相互作用、氢键和盐键这三种次级键来发生相互作用，形成中间复合物。实验证明，经过化学变性处理过的脂肪酶，在其折叠酶的协助下可以实现复性。在与脂肪酶结合的过程中，折叠酶的二级和三级结构都发生了明显的变化。有些研究表明：折叠酶协助相应的脂肪酶进行正确折叠后，不能再继续协助另一个脂肪酶的折叠，因而是单周转的催化剂。然而使用Northern印记实验却得出不同的结果。该实验表明虽然折叠酶基因和脂肪酶基因的转录是同步且等比例的，但是在它们转录完成后，编码折叠酶蛋白的mRNA有很大一部分被降解，因此产生的折叠酶的分子数会远远小于脂肪酶的分子数。这说明折叠酶蛋白协助对应脂肪酶正确折叠后，与该脂肪酶会发生分离，可以继续协助下一个对应脂肪酶分子的折叠，因而是多周转的催化剂(程蓝驿等,脂肪酶的特异性折叠酶,生物技术通报,2011,4:35-39)。

发明内容

本发明的目的在于提供一株Escherichia coli M4突变株及其制备方法和应用，至少在一定程度上解决现有技术中存在的问题。

本发明提供的一株Escherichia coli M4突变株，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏日期为2019年04月10日，保藏号为CCTCC NO:M 2019245。

上述的Escherichia coli M4突变株的制备方法，包括以下步骤：

(1)以携带Pseudomonas aeruginosa CS-2脂肪酶基因的pet28a-lip质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，将双酶切得到的基因片段与质粒pACYCDuet-1连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-lip；

(2)以携带Pseudomonas aeruginosa CS-2折叠酶基因的pet28a-fold质粒为模板，进行易错PCR扩增，易错PCR扩增产物经NdeI和XhoI双酶切，将双酶切得到的基因片段与重组质粒pACYCDuet-1-lip连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-lip-fold；

(3)将重组质粒pACYCDuet-1-lip-fold转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，接种至筛选培养基培养，经初筛后和复筛后，得到Escherichia coli M4突变株。