[发明专利]用改变ppc启动子的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法

说明书

本发明提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域；和，用改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的谷氨酸棒杆菌、多核苷酸等。

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。

背景技术

通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。

现有文献中有报道ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，phosphoenolpyruvatecarboxylase）基因、其调控元件及其编码蛋白的增加、减少或突变等用于氨基酸（包括L-赖氨酸）生产中，例如，WO0100844A2、WO2005058945A2、EP0358940A1和JP1998165180A等，然而，突变后的调控元件的性质是难以预料的，相应地，其对L-赖氨酸生产的影响也难以预料，尤其是，近十多年来，对ppc基因及其调控元件的突变对L-赖氨酸生产的影响的新的研究已经越来越少，表明研究人员对是否有新的ppc基因及其调控元件的突变来改善L-赖氨酸生产的兴趣已经越来越小了。

本发明人没有受到近十多年来的趋势影响，经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现对ppc基因调控元件的新的改造能够有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的产量。而且，该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的谷氨酸棒杆菌在相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造谷氨酸棒杆菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的突变蛋白、多核苷酸、载体和/或谷氨酸棒杆菌等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：

（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域，使该启动子区域缺失一个或几个核苷酸；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因或调控元件的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因或调控元件使得该基因或调控元件的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造，改造谷氨酸棒杆菌染色体上的野生型的ppc基因和/或其调控元件。因此，在本文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。

本发明人经过长期研究发现，在谷氨酸棒杆菌中，使野生型的ppc基因启动子区域发生缺失，尤其是在对ppc基因改造的情况下，可以提高L-赖氨酸的。在本发明的具体实施方式中，改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域，在ppc基因的第-1位缺失一个核苷酸。基因的-1位是基因编码区第一个密码子之前紧邻的一个核苷酸，这是本领域技术人员所熟知的。