[发明专利]一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法

说明书

本发明公开了一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法，所述的外源植物糖浆包括玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆；所述的引物探针组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～15所示，利用该组合物可以通过数字PCR快速准确测定出蜂蜜中是否含有外源植物糖浆。为进一步准确测量，所述的引物探针组合物还包括植物18s rRNA的保守同源序列设计内参基因的数字PCR检测引物和探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及蜂蜜及其产品中掺入外源植物糖浆的检测，具体为一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法。

背景技术

养蜂业是农业的一大组成部分，在我国的国民经济中占有较重要的地位。养蜂业不但能够向社会提供丰富的蜜蜂产品，而且还可以帮助农民脱贫致富，我国拥有蜂群数量820万群，平均年产蜂蜜30万吨，产量、出口量始终稳居于世界各国前列。近年来市场上蜂产品质量良莠不齐，一些蜂产品掺假、造假等欺骗消费者现象屡见不鲜，其中，向蜂蜜中掺入外源植物糖浆的情况比较严重和普遍，掺入的外源糖浆主要有大米糖浆、甜菜糖浆、玉米糖浆和甘蔗糖浆等，由于蜂蜜中的葡萄糖和果糖含量占其总量65％以上，而掺入的外源糖浆在感观及一些化学性质方面与蜂蜜中的糖的性质比较相近，所以掺入后其各项理化指标完全符合国家标准，甚至对一些理化指标还起到了强化作用，并且多种类型的糖浆同时用于蜂蜜掺假中的现象愈发严重，并且没有可同时检测到所有这些掺杂物的可利用的方法，目前针对蜂蜜中外源糖浆的检测方法主要利用同位素质谱法、薄层色谱法及红外光谱等方法，这些方法一方面比较费时费力，另一方面，有时只能针对一种类型糖浆的检测，无法满足对蜂蜜检测的需要。为了保护消费者的利益和蜂产业的健康发展，急迫需要发展新型的蜂蜜中外源糖浆的检测方法。

外源糖浆来源于植物，而每个物种都有其特有的内标准基因，根据稳定可靠的内标基因片段序列，设计出与靶序列两端互补的特异性可靠的寡核苷酸引物序列，通过PCR技术检测，如果可以扩出该段基因即可说明该样本中含有此物种，从而判断蜂蜜中是否掺入了相应植物来源的糖浆。由于从蜂蜜或糖浆中提取的少量DNA，及其中DNA的降解，需要更精确的PCR技术对其进行检测。数字PCR(Digital PCR，dPCR)是近几年新兴起的一种核酸绝对定量技术，可以很好的提高检测的灵敏度。dPCR是一种针对单分子目标DNA扩增的绝对定量技术，其原理是将含有DNA模板的反应液分配到大量独立的反应室中进行扩增，通过反应终点统计反应室里的阳性信号来达到绝对定量DNA拷贝数的新型PCR技术手段

数字PCR方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高等特点，不需要建立标准曲线，在蜂产品检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用数字PCR方法同时检测蜂蜜中的玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆和甘蔗糖浆的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于利用数字PCR扩增来源于外源糖浆中的相应植物的内标准基因，从而快速检测蜂蜜中是否掺入相应的植物糖浆的方法，主要用于同时快速鉴定蜂蜜中是否掺有大米糖浆、甜菜糖浆、玉米糖浆或甘蔗糖浆。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物，所述的外源植物糖浆包括玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆；

检测玉米糖浆引物探针组合物包括正向引物M-F、反向引物M-R和探针M-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；

检测大米糖浆引物探针组合物包括正向引物R-F、反向引物R-R和探针R-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示；

检测甜菜糖浆引物探针组合物包括正向引物B-F、反向引物B-R和探针B-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12所示；