[发明专利]利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向MSH2的方法

权利要求书

1.一种MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统，其特征在于：烟草双荧光素酶报告系统包含荧光虫荧光素酶(F-Luc)和海肾荧光素酶(R-Luc)；其中，R-Luc作为内参(常数)，且F-Luc的3′UTR区域中嵌入限制性酶切位点AvrII和AgeI。

2.按权利要求1所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统，其特征在于：所述系统为对双荧光素酶报告(即3′UTR sensor，Addgene 55206)质粒进行修饰，并于F-Luc的3′UTR区域中嵌入的限制性酶切位点AvrII和AgeI之间插入ath-miRNA170-3p的靶向基因-MSH2序列。

3.一种权利要求1所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：所述双荧光素酶报告系统在检测ath-miRNA170-3p在调控靶向拟南芥MSH2基因中的应用。

4.按权利要求3所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：

采用农杆菌介导的瞬时转化烟草叶片的双荧光素酶报告系统，检测植物ath-miRNA170-3p与靶基因的相互作用的应用。

5.按权利要求3所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：所述系统中R-Luc作为内参(常数)控制不同叶片或天数之间转化效率的差异，而F-Luc的3′UTR区域中嵌入了2个限制性酶切位点，限制性酶切位点之间插入靶向基因，利用农杆菌浸染烟草叶片的双荧光素酶报告系统，再通过双荧光素酶测定F-Luc/R-Luc的比值，即实现对植物ath-miRNA 170-3p与靶基因之间相互作用的检测。

6.一种烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的方法，其特征在于：

(1)构建权利要求1所述的烟草双荧光素酶报告系统，

(2)构建烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒，

(3)农杆菌浸染烟草，

(4)双荧光素酶活性检测，即实现利用系统的双荧光素酶的瞬时表达检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向相互关系。

7.按权利要求6所述的烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的方法，其特征在于：所述烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒为对GUS(Addgene ID55208)质粒进行修饰得到。

8.按权利要求6所述的烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向的方法，其特征在于：所述农杆菌浸染过程中双荧光素酶质粒与ath-miRNA 170-3p过表达质粒的农杆菌菌液比例为1:1-1:2。