[发明专利]一种毒素胁迫烟草杂种后代抗黑胫病基因型的定向选择方法

说明书

本发明提出了一种毒素胁迫烟草杂种后代抗黑胫病基因型的定向选择方法，离体条件下利用烟草黑胫病病原菌毒素胁迫烟草杂交分离世代种子，利用具不同抗黑胫病基因型种子在胁迫培养基上萌发时胚根及幼苗的生长特性，淘汰毒素敏感、胚根、幼苗生长受抑的萌发苗，筛选毒素胁迫条件下正常生长的抗性苗，进一步获得具不同抗性水平的烟草抗黑胫病基因型的方法。这种利用毒素胁迫烟草杂交后代进行抗黑胫病基因型的鉴选方法，克服了传统杂种后代抗黑胫病基因型鉴定、选择过程漫长、鉴定费力费时、选择效率较低的弊端，为烟草杂种后代抗黑胫病基因型的高效、定向选择提供了新的理论和方法。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种毒素胁迫烟草杂种后代抗黑胫病基因型的定向选择方法。

背景技术

烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var.nicotianae)是由卵菌纲(Oomycetes)疫霉属(Phytophthora)烟草疫霉引起的一种分布广泛、严重危害烟草生产的真菌性病害，每年因黑胫病给我国烟草行业造成巨大损失，其影响仅次于烟草病毒病。培育和种植抗黑胫病烟草品种是目前最为有效且经济环保的解决方法。在烟草抗黑胫病育种中，抗病基因型是通过分离世代多代抗病鉴定的方法进行抗病基因型鉴定和选择，鉴定、选择过程漫长而费力费时，且选择的效率较低，同时，烟草黑胫病的发病易受环境条件影响，给准确的评价鉴定材料的抗病水平带来了很大的不确定性。

因此，为了高效的培育烟草抗黑胫病的品种，建立一种稳定、高效的抗黑胫病基因型的鉴定和选择方法势在必行。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提出一种毒素胁迫烟草杂种后代抗黑胫病基因型的定向选择方法，解决传统杂种后代抗黑胫病基因型鉴定、选择过程漫长、鉴定费力费时、选择效率较低的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种毒素胁迫烟草杂种后代抗黑胫病基因型的定向选择方法，包括如下步骤：

步骤一、将烟草黑胫病菌菌种于产毒培养液中产毒培养后，分离得到烟草黑胫病菌粗毒素；

步骤二、将烟草杂种后代在毒素胁迫选择培养基上胁迫培养，胁迫培养的条件是：培养温度为27±2℃，光照为16h/d，培养天数为15天；

其中，毒素胁迫选择培养基是含有50％(v/v)烟草黑胫病菌粗毒素的胁迫生长培养基；

步骤三、根据胁迫培养的结果，筛选得到对毒素不敏感、种子萌发正常的抗毒素幼苗，将筛选出的抗毒素幼苗移植到温室进行苗期接种鉴定。

本发明还包括如下区别技术特征：

步骤一具体包括，将烟草黑胫病菌菌种于活化培养基中进行活化，活化后的菌种再在产毒培养液中产毒培养。

进一步，步骤一所述活化培养基为5％CA培养基，其制备方法为：取胡萝卜汁50mL，向其中加入β-谷甾醇0.02g、碳酸钙0.1g、琼脂8.0g，溶解后定容至1000mL，高压灭菌并分装，进行活化培养的条件是：23℃光照条件下培养4-7d。

进一步，步骤一所述产毒培养液制备方法为：在1000mL无菌水中加入600g去皮土豆煮沸10-15min，过滤除去土豆，定容1000mL，加入蔗糖50g、硫酸铵3.0g、硫酸镁0.8g，高压灭菌并分装；产毒培养接种的黑胫病菌菌饼0.5cm²，培养条件是26℃避光振荡培养24d。

可选的，步骤二胁迫培养前先对烟草黑胫病菌粗毒素进行毒性鉴定，将步骤一获得的烟草黑胫病菌粗毒素注射入活体烟草叶背的叶脉形成表皮渍斑，注入量为5-101L，通过48h后观察到的注射部位坏死斑的有无和大小判断毒性。

进一步，毒素胁迫选择培养基制备方法为：通用MS培养基中加入30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂粉和体积比为50％的烟草黑胫病菌粗毒素。